Bu teknik, minimum manipülasyonla birden fazla omik platformu için kullanılacak büyük ölçekli solucan popülasyonlarını toplamamızı sağlar. Bu teknik, her numunenin bütünsel bir resmini elde etmek için birden fazla omik deneyi boyunca karışık aşama C.elegans popülasyonlarını toplamamızı sağlar. Gravid yetişkinlerin büyük ölçekli kültür plakalarına lekeli ağartması için, bir Solucan topunun üzerine bir Bunsen brülörünün üzerine alevlendirin ve bakteri çimlerinin kenarından büyük ölçekli bir kültür tabağına taze E.coli almak için kazmayı kullanın.
Spot ağartma için dördüncü parça plakasından tek bir gravid yetişkin seçin ve E.coli çimlerinden uzakta büyük ölçekli kültür plakasının bir köşesine beş mikrolitre taze hazırlanmış alkalin hipoklorit çözeltisi ekleyin. Gravid yetişkini alkali hipoklorit çözeltisine yerleştirin ve manisi bozmak ve yumurtaları serbest bırakmak için nematoda dokunun. Toplam beş yetişkin aynı şekilde E.coli çimlerinin etrafına eşit olarak yerleştirildiğinde, kapağı tekrar tabağa yerleştirin.
Büyük ölçekli kültür plakalarından numune toplamak için, bir büyük ölçekli kültür plakası yüzeyine 50 mililitre M9 çözeltisi dökün ve M9'un tüm nematod büyüme ortamı agarose yüzeyini kapladığından emin olmak için plakayı döndürün. M9 ile steril bir serolojik pipet astarlayın ve plakayı, M9 ve solucan popülasyonunun plakanın bir köşesinde toplanması için eğin. Solucan süspansiyonu aspire etmek ve solucanları 50 mililitrelik konik bir tüpe eklemek için astarlı pipeti kullanın.
Herhangi bir bakteri kümelerini ve döküntülerini bozmak için tüpü bir rocker üzerine yerleştirin. Solucanların tümü üç plakadan da toplandığında, her tüpten 15 mililitre solucanı üç 15 mililitre konik tüpün her birine aktarın ve solucanları santrifüjleme ile tüplere çökeltin. Solucan topaklarını bozmadan süpernatantları dikkatlice emiş ve her tüpe 13 mililitre solucan süspansiyonu ekleyin.
Peletleri yeniden yıkamak ve mümkün olduğunca fazla bakteri ve döküntüsü yıkamak ve solucanları tekrar santrifüjlemek için tüpleri ters çevirin. Her solucan popülasyonu toplandığında, solucan topaklarını yıkama başına 10 mililitre taze M9 çözeltisinde üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, temizlenen her solucan peletini 10 mililitre çift damıtılmış suda yeniden ıslatın.
Nüfus büyüklüğü tahmini için, her tüpten üç adet 100 mikrolitre solucan örneğini numune başına 900 mikrolitre M9 çözeltisinde hızla seyreltin ve seri seyreltmeler yapmak için aliquotları kullanın. Aliquotlar sayılırken kültürlerin sürekli hareketi için stok solucanı örnek süspansiyonlarını bir rocker üzerine yerleştirin ve solucan seyreltmelerini homojen olana kadar karıştırın. Cam mikroskop kaydırağına ilkinden 10 solucan örneğine beş mikrolitre çözelti ekleyin ve solucanları hafif mikroskopi ile sayın.
Örnekte 50'den az solucan varsa, 1:100 ve 1:1, 000 seyreltmeleri sayın. 50'den fazla solucan varsa, bir sonraki seri seyreltmeye geçin. Her seyreltmenin her aliquot çoğaltmasını üç kez saydıktan sonra, solucanın tahmini popülasyon boyutunu belirlemek için ortalama seyreltme sayısı.
Daha sonra solucan örneklerini uygun deneysel aliquotlara bölün ve numuneleri eksi 80 santigrat derece depolama için sıvı nitrojende dondurun. Büyük parçacık akış sitometrisi için bir solucan örneği hazırlamak için, dördüncü karışık aşama solucan aliquot'u 10 mililitrelik son bir M9 çözeltisi hacmine yaklaşık beş kez seyreltin ve solucan süspansiyonu için mililitre E.coli başına bir miligramdan 200 mikrolitre ve 0,5 mikromoler kırmızı floresan mikrokürez çözeltisinin 1:50 seyreltilmesini ekleyin. Sallanma ile oda sıcaklığında 20 dakikalık bir inkübasyondan sonra, solucanları ve mikroküreleri santrifüjleme ile toplayın ve solucanları taze M9 çözeltisi ile iki kez yıkayarak fazla bakterileri ve ilgisiz mikroküreleri giderin.
İkinci yıkamadan sonra, peletı beş mililitre M9 çözeltisinde yeniden kullanın. Pelet temiz görünüyorsa, solucanlara 50 milimoler sodyum azit ile desteklenmiş beş mililitre M9 ekleyin ve doğru sayım ve boyutlandırma için solucanları hem düzleştirmek hem de ötenazi yapmak için tüpü bir rocker üzerine yerleştirin. Nüfus dağılımı belgeleri için, kalibre edilmiş 384 kuyu plakası şablonunun açılışını açın ve şablonu, numunenin 20 çubuk bölgesinin her biri için her kapılı bölgenin dört teknik çoğaltmasını elde etmek üzere 20 kapılı nesneyi dört kuyuya dağıtacak şekilde ayarlayın.
Büyük parçacık akışlı sitometreye 40 mililitrelik bir solucan örneği yükleyin ve numuneden kalibre edilmiş 384 kuyu plakasına nesnelerin yerleştirilmesini ve aynı anda dağıtılmasını önlemek için numuneyi sürekli karıştırırken numuneyi otomatik olarak sıralamaya başlayın. Numunenin tamamı sıralandıktan ve maksimum kapılı bölge sayısı 384 kuyu plakasına dağıtıldıktan sonra, numuneyi sitometreden çıkarın ve cihazı temizleyin. Büyük ölçekli kültür plakası yöntemi, Caenorhabditis Genetics Center mutantları ve Caenorhabditis elegans Natural Diversity Resource vahşi suşlarının bir karışımı da dahil olmak üzere 15 C.Elegans türü üzerinde test edildi.
Bu analizde, büyük ölçekli kültür plakası yöntemi yaklaşık 94, 500 ila 9, 290,000 arasında nüfus büyüklüğü sağlamıştır. Referans suş PD1074 ve suşlar boyunca ortalama popülasyon büyüklüğü yaklaşık 2,4 milyon solucandı. Ortalama 12,2 büyük ölçekli kültür plakası büyüme günü boyunca C.elegans suşları arasındaki tahmini nüfus boyutlarında anlamlı bir fark bulunmadı.
PD1074 büyük ölçekli kültür plakalarının ortalama 12,2 günlük büyüme süresi ile tam bir karma aşama popülasyona büyümesi 10 ila 14 gün sürdü. En yavaş büyüyen suş en fazla 20 gün, en hızlı büyüyen suş ise en az 10 gün büyüdü. PD1074 için bu örnek dağılımında, solucanlar L1 aşamasından gravid yetişkine kadar büyük bir parçacık akış sitometresi üzerinde ölçüldü.
Daha sonra örnekler arasında popülasyon dağılımındaki varyasyonların görüntülenmesi ve görselleştirilmesi, boru hattının karışık bir C.elegan popülasyonu oluşturduğunu ortaya koydu. Solucanları örnek toplama boyunca doğru bir şekilde saymak önemlidir, böylece büyümeler ve çalışmalar arasında karşılaştırılabilir veriler elde edersiniz. Bu toplama yaklaşımı, C.elegans popülasyonlarında meydana gelen karmaşık dinamikleri anlamamızı genişletmek için RNA dizileme, genomik ve diğer omik analizlerine uygulanabilir.
Bu teknik, her numunenin bütünsel bir resmini elde etmek için birden fazla omik deneyi boyunca karışık aşamalı C.elegans popülasyonlarını toplamamızı sağlar.
