Esta técnica nos permite recolectar poblaciones de gusanos a gran escala para ser utilizadas para múltiples plataformas ómicas con una manipulación mínima. Esta técnica nos permite recolectar poblaciones mixtas de C.elegans en estadios a través de múltiples experimentos ómicos para obtener una imagen holística de cada muestra. Para el blanqueamiento puntual de adultos grávidos en placas de cultivo a gran escala, llame un pico de gusano sobre un quemador Bunsen y use el pico para extraer E. coli fresca del borde del césped bacteriano en una placa de cultivo a gran escala.
Elija un solo adulto grávido de la placa de cuarto trozo para el blanqueamiento puntual y agregue cinco microlitros de solución de hipoclorito alcalino recién preparada en una esquina de la placa de cultivo a gran escala lejos del césped de E. coli. Coloque al adulto grávido en la solución de hipoclorito alcalino y toque el nematodo para interrumpir la cutícula y liberar huevos. Cuando un total de cinco adultos se han colocado uniformemente alrededor del césped de E. coli de la misma manera, coloque la tapa de nuevo en la placa.
Para cosechar muestras de placas de cultivo a gran escala, vierta 50 mililitros de solución M9 en una superficie de placa de cultivo a gran escala y gire la placa para asegurarse de que el M9 cubra toda la superficie de agarosa mediana de crecimiento de nematodos. Preparar una pipeta serológica estéril con M9 e inclinar la placa para que la M9 y la población de gusanos se reúnan en una esquina de la placa. Utilice la pipeta preparada para aspirar la suspensión del gusano y agregue los gusanos a un tubo cónico de 50 mililitros.
Coloque el tubo en un balancín para interrumpir cualquier agrupación bacteriana y escombros. Cuando todos los gusanos se han recogido de las tres placas, transferir 15 mililitros de gusanos de cada tubo en cada uno de los tres tubos cónicos de 15 mililitros y sedimentar los gusanos en los tubos por centrifugación. Aspirar cuidadosamente los sobrenadantes sin molestar los pellets de gusano y añadir 13 mililitros de suspensión de gusano a cada tubo.
Invierta los tubos para resuspend los pellets y para lavar la mayor cantidad posible de bacterias y escombros y centrifugar los gusanos de nuevo. Cuando se haya recogido toda cada población de gusanos, lave los pellets de gusano tres veces en 10 mililitros de solución M9 fresca por lavado. Después del último lavado, resuspend cada pellet de gusano limpiado en 10 mililitros de agua destilada doble.
Para la estimación del tamaño de la población, diluya rápidamente tres alícuotas de 100 microlitros de muestra de gusano de cada tubo en 900 microlitros de solución M9 por muestra y use las alícuotas para hacer diluciones en serie. Coloque las suspensiones de muestra de gusano común en un balancín para el movimiento continuo de los cultivos mientras se cuentan las alícuotas y mezcle las diluciones de gusano hasta que sean homogéneas. Agregue cinco microlitros de solución desde el primero a 10 muestras de gusanos a un portaobjetos de microscopio de vidrio y cuente los gusanos por microscopía de luz.
Si hay menos de 50 gusanos en la muestra, cuente las diluciones 1:100 y 1:1, 000. Si hay más de 50 gusanos, pase a la siguiente dilución en serie. Después de contar cada réplica alícuota de cada dilución tres veces, promediar los recuentos de dilución para determinar el tamaño estimado de la población del gusano.
Luego divida las muestras de gusano en las alícuotas experimentales apropiadas y congele las muestras en nitrógeno líquido para un almacenamiento de menos 80 grados Celsius. Para preparar una muestra de gusano para citometría de flujo de partículas grandes, diluya aproximadamente cinco veces 10 a la cuarta etapa mixta alícuota de gusano a un volumen final de 10 mililitros de solución M9 y agregue 200 microlitros de un miligramo por mililitro E. coli y 1:50 de dilución de 0,5 micromolares rojos de solución fluorescente fluorescente a la suspensión del gusano. Después de una incubación de 20 minutos a temperatura ambiente con balanceo, recoja los gusanos y microesferas por centrifugación y lave los gusanos dos veces con una solución M9 fresca para eliminar cualquier exceso de bacterias y microesferas no internalizadas.
Después del segundo lavado, resuspend el pellet en cinco mililitros de solución M9. Si el pellet se ve limpio, agregue cinco mililitros de M9 complementados con azida de sodio de 50 milimolares a los gusanos y coloque el tubo en un balancín para enderezar y eutanasiar los gusanos para un conteo y dimensionamiento precisos. Para la documentación de distribución de la población, abra la plantilla calibrada de placa de 384 pozos y configure la plantilla para dispensar 20 objetos bloqueados en cuatro pozos para obtener cuatro réplicas técnicas de cada región cerrada para cada una de las 20 regiones de barra de la muestra.
Cargue una muestra de gusanos de 40 mililitros en el citómetro de flujo de partículas grandes y comience a clasificar automáticamente la muestra mientras agita continuamente la muestra para evitar la sedimentación y dispensación simultánea de objetos de la muestra en la placa calibrada de 384 pozos. Una vez que se haya clasificado toda la muestra y se haya dispensado el número máximo de regiones cerradas en la placa de 384 pozos, retire la muestra del citómetro y limpie el instrumento. El método de placa de cultivo a gran escala se probó en 15 cepas de C.Elegans, incluida una mezcla de mutantes del Centro de Genética Caenorhabditis y cepas silvestres de Caenorhabditis elegans Natural Diversity Resource.
En este análisis, el método de placa de cultivo a gran escala produjo tamaños de población de aproximadamente 94, 500 a 9, 290, 000. El tamaño medio de la población dentro de la cepa de referencia PD1074 y a través de las cepas fue de aproximadamente 2,4 millones de gusanos. No se encontraron diferencias significativas en los tamaños de población estimados entre las cepas de C.elegans en el transcurso de un promedio de 12,2 días de crecimiento de placas de cultivo a gran escala.
Las placas de cultivo a gran escala PD1074 tardaron entre 10 y 14 días en crecer a una población de etapa mixta completa con un tiempo de crecimiento medio de 12,2 días. La cepa de crecimiento más lento creció durante un máximo de 20 días y la cepa de más rápido crecimiento creció durante un mínimo de 10 días. En esta distribución de la muestra para PD1074, los gusanos fueron medidos de la etapa L1 con adulto grávido en un citómetro grande del flujo de la partícula.
Las imágenes posteriores y la visualización de las variaciones en la distribución de la población a través de las muestras revelaron que la tubería generó una población de etapa mixta de C.elegans. Es importante contar con precisión los gusanos a lo largo de la colección de muestras para obtener datos comparables entre crecimientos y estudios. Este enfoque de recolección se puede aplicar a la secuenciación de ARN, genómica, y otros análisis ómicos para ampliar nuestra comprensión de la dinámica complicada que se producen dentro de las poblaciones de C.elegans.
Esta técnica nos permite recolectar poblaciones mixtas de C.elegans en etapas a través de múltiples experimentos ómicos para obtener una imagen holística de cada muestra.
