Esta técnica nos permite coletar populações de vermes em larga escala para serem usadas para múltiplas plataformas de omics com manipulação mínima. Esta técnica nos permite coletar populações de C.elegans em estágio misto em múltiplos experimentos de omics para obter uma imagem holística de cada amostra. Para o branqueamento de manchas de adultos gravid em placas de cultura em grande escala, flame um worm pick over a Bunsen burner e use a escolha para colher E.coli fresco da borda do gramado bacteriano em uma placa de cultura em grande escala.
Escolha um único adulto gravid a partir da placa do quarto pedaço para branqueamento de manchas e adicione cinco microliters de solução de hipoclorito alcalino recém-preparada em um canto da placa de cultura em grande escala longe do gramado E.coli. Coloque o adulto gravid na solução alcalina de hipoclorito e toque no nematoide para interromper a cutícula e liberar ovos. Quando um total de cinco adultos foram colocados uniformemente ao redor do gramado E.coli da mesma maneira, coloque a tampa de volta na placa.
Para colher amostras de placas de cultura em larga escala, despeje 50 mililitros de solução M9 em uma superfície de placa de cultura em larga escala e gire a placa para garantir que o M9 cubra toda a superfície média de crescimento de nematoides. Prime uma pipeta sorológica estéril com M9 e incline a placa para que a população de M9 e vermes se reúna em um canto da placa. Use a pipeta preparada para aspirar a suspensão do verme e adicionar os vermes a um tubo cônico de 50 mililitros.
Coloque o tubo em um roqueiro para interromper qualquer aglomerado bacteriano e detritos. Quando todos os vermes tiverem sido coletados das três placas, transfira 15 mililitros de vermes de cada tubo para cada um dos três tubos cônicos de 15 mililitros e sedimente os vermes nos tubos por centrifugação. Aspire cuidadosamente os supernantes sem perturbar as pelotas de vermes e adicione 13 mililitros de suspensão de vermes a cada tubo.
Inverta os tubos para resuspengar as pelotas e lavar o máximo de bactérias e detritos possível e centrifugar os vermes novamente. Quando toda a população de vermes tiver sido coletada, lave as pelotas de verme três vezes em 10 mililitros de solução M9 fresca por lavagem. Após a última lavagem, resuspenda cada pelota de verme limpa em 10 mililitros de água dupla destilada.
Para a estimativa do tamanho populacional, dilui rapidamente três alíquotas de 100 microliteres de amostra de vermes de cada tubo em 900 microliters de solução M9 por amostra e use as alíquotas para fazer diluições seriais. Coloque as suspensões da amostra de vermes em um roqueiro para o movimento contínuo das culturas enquanto as alíquotas estão sendo contadas e misture as diluições de vermes até que sejam homogêneas. Adicione cinco microlitros de solução da primeira amostra de vermes a 10 amostras de vermes a um slide de microscópio de vidro e conte os vermes por microscopia leve.
Se houver menos de 50 vermes na amostra, conte as diluições de 1:100 e 1:1.000. Se houver mais de 50 vermes, mova-se para a próxima diluição serial. Após contar cada réplica de alíquota de cada diluição três vezes, a média da diluição conta para determinar o tamanho populacional estimado do verme.
Em seguida, divida as amostras de vermes nas alíquotas experimentais apropriadas e congele as amostras em nitrogênio líquido para menos 80 graus Celsius de armazenamento. Para preparar uma amostra de vermes para grande citometria de fluxo de partículas, diluir cerca de cinco vezes 10 para o quarto aliquot de vermes de estágio misto para um volume final de 10 mililitros de solução M9 e adicionar 200 microlitadores de um miligrama por mililitro E.coli e 1:50 diluição de 0,5 micromolar solução fluorescente fluorescente para o worm de suspensão. Após uma incubação de 20 minutos à temperatura ambiente com balanço, colete os vermes e microesferas por centrifugação e lave os vermes duas vezes com uma solução M9 fresca para remover qualquer excesso de bactérias e microesferas não internizadas.
Após a segunda lavagem, resuspenja a pelota em cinco mililitros de solução M9. Se a pelota parecer limpa, adicione cinco mililitros de M9 suplementados com 50 milimões de sódio azida aos vermes e coloque o tubo em um roqueiro para endireitar e eutanásia os vermes para contagem e dimensionamento precisos. Para a documentação de distribuição populacional, abra o modelo calibrado de placa de 384 poços e defina o modelo para dispensar 20 objetos fechados em quatro poços para obter quatro réplicas técnicas de cada região fechada para cada uma das 20 regiões da barra da amostra.
Carregue uma amostra de 40 mililitros de vermes no grande citômetro de fluxo de partículas e comece a classificar automaticamente a amostra enquanto agita continuamente a amostra para evitar a acomodação e simultaneamente distribuindo objetos da amostra para a placa calibrada de 384 poços. Uma vez que toda a amostra tenha sido classificada e o número máximo de regiões fechadas tenham sido dispensados na placa de 384 poços, remova a amostra do cítmetro e limpe o instrumento. O método de placa de cultura em larga escala foi testado em 15 cepas de C.Elegans, incluindo uma mistura de mutantes do Centro de Genética de Caenorhabditis e caenorhabditis elegans Natural Diversity Resource ceps selvagens.
Nesta análise, o método de placa de cultura em larga escala rendeu tamanhos populacionais de aproximadamente 94.500 a 9.290.000. O tamanho médio da população dentro da cepa de referência PD1074 e entre as cepas foi de aproximadamente 2,4 milhões de vermes. Não foram encontradas diferenças significativas nos tamanhos populacionais estimados entre as cepas de C.elegans ao longo de uma média de 12,2 dias de crescimento de placas de cultura em larga escala.
As placas de cultura de grande escala PD1074 levaram entre 10 a 14 dias para crescer para uma população de estágio misto completo com um tempo médio de crescimento de 12,2 dias. A tensão de crescimento mais lenta cresceu por um máximo de 20 dias e a cepa de crescimento mais rápido cresceu por um mínimo de 10 dias. Nesta distribuição amostral para PD1074, os vermes foram medidos a partir do estágio L1 através de adulto árvid em um grande citômetro de fluxo de partículas.
Imagens subsequentes e visualização das variações na distribuição populacional entre as amostras revelaram que o gasoduto gerou uma população em estágio misto de C.elegans. É importante contar com precisão os vermes ao longo da coleta de amostras para que você obtenha dados comparáveis entre crescimentos e estudos. Essa abordagem de coleta pode ser aplicada ao sequenciamento de RNA, genômica e outras análises omicas para expandir nossa compreensão da dinâmica complicada que ocorrem dentro das populações de C.elegans.
Esta técnica nos permite coletar populações de C.elegans em estágios mistos em vários experimentos de omics para obter uma imagem holística de cada amostra.
