この方法は、生物試料をネイティブ環境に保ち、電子ビーム誘導アーティファクトを低減します。主な利点は、この技術が細胞全体に適用可能であるということです。したがって、細胞は電子顕微鏡の前に脱水、染色、または切除する必要はありません。
無傷の形質膜全体の文脈で癌細胞の受容体を画像化する能力は、新しい治療法のアプローチと新しい抗癌剤の開発につながる主要な側面です。細胞、グラフェンコーティング、顕微鏡検査の研究を実演し、セルカン・ケスキンがグラフェンの作製方法を紹介します。まず、PLLとFLPコーティングされたマイクロチップを含む96ウェルプレートの2つのウェルに100マイクロリットルの細胞懸濁液を加え、窒化ケイ素膜を上に向け、50マイクロリットルの無血清培地を加えます。
プレートを摂氏37度、炭酸ガス5%5%で5分間インキュベートし、細胞をマイクロチップに取り付けることができます。マイクロチップ上の細胞の密度を反転した顕微鏡で確認し、細胞が平らにして付着するのに十分なスペースで窓を覆っていることを確認します。細胞内にHER2のラベルを付けるには、マイクロチップをラベリングプレートの最初の行の井戸に入れる。
次に、PBS BSAでマイクロチップを洗浄します。抗体模倣体の非特異的結合を防ぐために、マイクロチップをPBS BSA GSと5分間インキュベートする。その後、200ナノモル抗体模倣体を摂氏37度で10分間、炭酸ガス5%で模倣した。
ポリマーからPMMAグラフェンを除去するために、PMMAグラフェンの周囲のポリマー上の水滴を数滴ピペットする。次いで、30〜45度の角度で水中に浸し、PMMAグラフェンを放出する。銅系汚染物質をエッチングするには、50ミリリットルの溶液を0.42モル硫酸ナトリウムを水中に入れます。
標準的なガラススライドを使用して、グラフェン側を下にしてPMMAグラフェンを過硫酸ナトリウム溶液に移します。PMMAグラフェンは、溶液の上部に浮かびます。一晩そこに置いておきなさい。
翌日、過硫酸ナトリウム溶液からPMMAグラフェンをきれいな水に移します。30分間水に浮かべましょう。PMMAグラフェンから過硫酸ナトリウム残渣をすべて除去するために、合計3回洗浄を繰り返します。
次いで、PMMAグラフェンを塩化ナトリウム結晶上に移します。ペトリ皿の水中に塩化ナトリウムの飽和溶液を調製し、グラフェン側を下にして溶液の上にPMMAグラフェンを移します。ピンセットで塩化ナトリウム結晶を保持し、浮遊PMMAグラフェンを拾います。
その後、2分間垂直に保持し、余分な水が流出させます。室温まで30分乾燥させ、オーブンで100度で20分間焼きます。水を完全に取り除きます。
ガラスペトリ皿にアセトンを煙のフードのホットプレートで約50°Cに予熱します。火を避けるために温度を注意深く見てください。PMMAグラフェンを塩分に浸してアセトンを入れたペトリ皿に浸し、PMMAを30分間溶解させます。
サンプル調製に使用する前に、塩空気乾燥にグラフェンを十分に乾燥させてください。調製したマイクロチップを純水で洗浄し、塩の残渣を緩衝液から取り除き、濾紙に貼ります。細胞は暗い斑点として表示されるはずです。
カミソリの刃を使用して、塩化ナトリウム結晶の多層グラフェンをマイクロチップの窒化ケイ素の窓に合う部分にカットします。塩化ナトリウム結晶からグラフェンを水のビーカーに浸して取り出し、表面に対して45度の角度で結晶を傾けます。水面から金属ループでグラフェンをキャッチし、下のループ表面でマイクロチップの上面に触れ、マイクロチップが金属ループにくっつきます。
グラフェンはマイクロチップの上に見ることができます。実体顕微鏡では、フィルターペーパーを使用してマイクロチップから残りの水を取り除き、グラフェンが窒化ケイ素シリコンウィンドウ上のすべてのセルを覆います。マイクロチップをピンセット付きのフィルターペーパーに置きます。
グラフェンはマイクロチップ上の紫色のきらめきとして見える。マイクロチップを紙からコンパートメントペトリ皿に移します。水の液滴をフリーコンパートメントの1つにピペットし、蓋を閉じて水飽和雰囲気を提供します。
その後、パラフィンフィルムでコンパートメント皿を密封し、冷蔵庫に4度で保存します。凝縮レンズを調整して、プローブサイズが0.2ナノメートル以上のアライメントサンプルを使用して、STEMを200キロボルトビームエネルギーに設定します。開口を挿入して、180ピコアアンペアのプローブ電流とビーム収束半角13.2ミリラジアンを設定します。
プロジェクター・レンズの設定を調整して、ADF STEM検出器の半角度の範囲を68~280ミリラジアンに設定します。次に、STEM 画像サイズを 2048 x 2048 ピクセルに、ピクセルのドウェル時間を 6 マイクロ秒に設定します。グラフェンコーティングされた細胞を持つマイクロチップを、細胞が上向きになるようにテム用の標準的な標本ホルダーにロードし、ホルダーを電子顕微鏡にロードします。
800 X 倍率で概要画像を取得します。次に、1.3ナノメートルのピクセルサイズで80,000 Xの量子ドットナノ粒子の対象領域および画像を同定する。最適に播種された細胞がここに示されている。
窓は覆われていますが、平らにして付着するのに十分なスペースがあります。マイクロチップに播種した細胞が多すぎると、全ての細胞が接着するスペースが不十分であった。24時間後、細胞の半分以上が平らではなかった。
播種された細胞が少なすぎると、窒化ケイ素のシリコンウィンドウは24時間後に大きな空きスペースになります。DICおよび最適に播種された細胞の蛍光画像をここに示し、HER2の標識に成功したことを示している。STEMはグラフェンコーティングおよび非コーティングSKBR3細胞に対して行った。
800 X倍率画像のインセットは80,000 Xで画像化され、量子ドットナノ粒子は50,000 X倍率で明るいスポットとして見える。試料に対する電子線照明の効果を調べるには、電子線量を蓄積した画像シリーズでSTEM画像を取得した。非コーティングおよびグラフェンコーティングされたサンプルの代表的な結果を以下に示す。
非コーティングされたサンプルの露出は、グラフェンコーティングされたサンプルのいずれにも発生しなかった明るい構造が細胞表面に現れる原因となった。粒子対の平均相対距離変化は、非コーティングサンプルでは1.3%以下、コーティングされたサンプルでは0.8%未満にとどまった。この手順に従って、他の顕微鏡法を用いて、異なる種類の膜タンパク質を全細胞上で画像化することができる。
この技術により、無傷の血漿膜中のタンパク質を画像化して、その血漿膜の組織およびタンパク質間の相互作用に関するより多くの情報を得ることを可能にする。
