このプロトコルは、その2次元画像から細胞内構造の面積、周長、形状の定量化を可能にする。この技術は、迅速かつ簡単で、唯一の標準的な実験室の設定と共焦点顕微鏡を必要とし、オープンソースソフトウェアを使用しています。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の博士課程の学生、アンナ・バルセラクです。
摂氏37度と5度の二酸化炭素インキュベーターで24時間培養するために、4ウェルコラーゲン1コーティングチャンバースライドで、ウェルあたり0.5ミリリットルの培養培地に10〜5番目の細胞を4回播種することから始めます。翌朝、光学反転顕微鏡を使用して、少なくとも90%コンフルエント単層の存在を確認し、共焦点顕微鏡を使用して単一のZスライス画像を得る。焦点接着解析では、ImageJ で画像を開き、解析、尺度の設定、尺度の削除、およびグローバルを選択して、イメージのスケールをピクセル単位で設定します。
計測オプションに対象領域のファイル名と領域を含めるには、[解析]をクリックして測定値を設定し、面積と表示ラベルオプションを確認します。背景を減算するには、プロセスを選択し、背景を減算します。ローリングボールの半径を50ピクセルに設定し、スライド式放物線をチェックします。
関心の最小領域の面積を決定するには、最小の単一焦点接着を概説し、分析をクリックして面積を測定します。対象となる領域が少なくとも 20 個選択され、測定された場合は、得られた結果の平均値を計算して保存します。上部境界を一般的なセル領域の 25% に設定します。
画像をバイナリに付与するには、画像、調整、およびしきい値をクリックし、デフォルト、白黒、および暗い背景を確認します。対象領域の数と領域を測定するには、粒子の解析と分析を選択してピクセル単位を確認し、結果を表示し、結果をクリアし、集計します。スライス、カウント、および合計エリア平均サイズデータを要約ウィンドウから選択したデータ管理プログラムに転送します。
焦点接着定量のために、焦点接着ImageJマクロを開き、関心の最小領域パラメータの面積として関心の最小領域の領域を入力します。しきい値の種類の値を手動または自動に設定し、変更を保存します。次に、ImageJ からマクロを呼び出し、処理するイメージを選択します。
手動のセル形状解析では、適切な画像処理ソフトウェアプログラムで画像を開き、測定するパラメータを選択します。フリーハンド選択ツールを使用して、選択した結合タンパク質によってマークされたセル境界を手動で線分します。選択したパラメータは、セルごとに自動的に計算されます。
すべてのセルのアウトラインが作成されたら、[編集]、[選択]、および [マネージャに追加] を選択します。罫線が途切れない完全な可視セルのみを選択する必要があります。測定を行う場合は、関心領域マネージャーの左側のボックスに表示されるすべての数値をマークし、[メジャー] をクリックします。
結果は結果ボックスに表示され、選択したスプレッドシートにインポートできます。自動化された細胞分析は多数の細胞の定量化を促進する。新しいセルの種類ごとに、まずマクロを実行してパラメータを設定します。
マクロが終了したら、[セル サイズの境界を設定する] を選択します。最小セルと最大セルのラベルをクリックし、[メジャー] をクリックします。最小セルと最大セル変数の値を設定し、変更を保存します。
すべてのマクロ ウィンドウを閉じ、グレースケールで処理するイメージを選択します。その後、マクロを再実行します。このマクロは、セル図形のインデックス、縦横比、および対象となる選択リスト データの領域を含む結果のテーブルを提供します。
ここで、最終的な番号のアウトラインと、コントロールとノックダウンの両方の細胞線の元の画像を持つ焦点接着の輪郭のオーバーレイを含むImageJでカウントされた焦点接着の代表的な画像が観察できる。この分析で示されるように、ノックダウン細胞は、コントロールセルライン細胞と比較して、より大きなサイズの接着と同様に、細胞あたりの接着の数が多いことを実証しました。これらの画像では、未治療および化学療法的に処置された細胞単層の代表的領域が示されている。
この分析では、この分析では、最後のビンの増加と、薬物処理された細胞の主ピークの平坦化を未治療の対照と比較して、それらの細胞形状の指標値に従って特徴付けた。その後、各細胞培養に対して周波数分布と累積分布を生成できます。実演したように単層のグレースケールイメージングは、12の視野から512個の細胞の分析と定量を可能にし、細胞形状指数の相対的な周波数分布を明らかにした。
このプロトコルを動作させるためには、可能な限り最高の品質のイメージを使用することが重要です。適切な細胞の播種、染色、およびイメージングは、十分な実験品質の画像を確保する必要があります。
