ポリグルタミン凝集を評価し、ハイスループットアプリケーションに使用できるフレームワークを提供することにより、プロテオスタシスの変化を監視するための簡単なアプローチが取られました。集計数などの表現型をスコアリングすることで主観的になり得る。集計カウントを自動化することで、このようなバイアスを排除し、スループットと再現性を向上させることができます。
この方法は、宿主プロテオスタシス破壊に寄与する細菌遺伝子を同定するのに役立つ。個々の細菌遺伝子の寄与を理解することは、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの疾患の病因におけるその影響を理解するのに役立ちます。まず、ワームを含むプレートを冷凍庫から取り出し、室温で解凍させます。
その後、余分な結露を拭き取り、フタを外してからイメージングを行います。画像キャプチャ中に、露光時間500ミリ秒、倍率40 X、0.63 Xカメラアダプター、GFP強度を100%に設定した顕微鏡設定を使用します。次に、ワームが暗い背景と比較して明るく照らされて表示されるまで、透過光コントロールを調整して、露出過多を回避します。
10マイクロリットルのピペットチップを使用してワームを目的の位置に穏やかに押し込むことにより、ウェル内のワームの位置を変更して過度の凝集を防ぎます。チャンネルをGFPフィルタに設定して、両方の画像の焦点面を確立します。明視野画像をキャプチャします。
プレートを乱すことなく、または顕微鏡の焦点を変えることなく、対応する蛍光画像を撮影します。次に、画像を評価するには、まず CellProfiler をダウンロードします。ソフトウェアを開き、目的の画像を画像ボックスにドラッグアンドドロップします。
ファイルリスト内の画像をクリックして開きます。拡大鏡ガラスを選択して関心領域を強調表示し、矢印アイコンを選択してワームと凝集体の両方の長さを測定します。目的のオブジェクトにカーソルを合わせると、画面の下部に表示される強度の値が表示されます。
CellProfiler画像解析パイプラインを利用するには、公式WebサイトからCellProfilerをダウンロードした後、テキスト原稿の説明に従って画像ペアに適切な名前を付けます。パイプラインをダウンロードし、ファイル、インポート、およびファイルからのパイプラインを選択して、CellProfiler にアップロードします。もつれのないワームモジュールを選択して設定を開き、もつれのないワームモジュール内のワームを識別するために使用されるトレーニングセットをロードします。
次に、トレーニングセットのファイル名を特定します。ファイルのアップロードアイコンを選択し、補足ファイルもアップロードします。左上隅にある画像モジュールを選択して、画像をアップロードします。
そして、適切な名前の画像をドラッグアンドドロップします。画像を分析する前に、プログラムの左下隅近くにある出力設定ボタンをクリックして、結果を保存するために使用される目的の出力フォルダを選択します。次に、デフォルトの出力の右側にあるフォルダアイコンを選択して、目的の出力場所を選択します。
[画像の分析] アイコンを選択して、画像分析を開始します。分析の完了に時間がかかりすぎて、1 つのイメージの処理が停止している場合は、実行を中止し、出力フォルダーを並べ替えて、見つからないイメージ名を書き留めて、未処理のイメージを識別します。完全な分析の後、ソフトウェアは、列Nの個々のワームと列K.Downloadの集計のそれぞれの数を含むExcelスプレッドシートに結果を整理し、CellProfilerからの出力CSVファイルからのデータを便利に整理します。
Windows OSの場合は、ダウンロードしたファイルを見つけて目的の場所に解凍します。gui_Windowsos_64xという名前の抽出されたフォルダーを見つけて開きます。GUIアプリケーションアイコンをクリックしてアプリケーションを起動します。
実行の許可を要求するプロンプトが開くことがあります。詳細情報を選択し、[実行]をクリックします。これで、メタデータ オーガナイザーは、CellProfiler 出力 CSV ファイルをドラッグ アンド ドロップする準備ができました。
Mac OS の場合は、ダウンロードしたファイルを見つけて、ファイル・メタデータ・オーガナイザー・アプリケーション・ファイルを抽出します。ダウンロードで見つかった抽出されたフォルダを開きます。GUIアプリケーションを右クリックし、[開く]を選択します。
公式ライセンスがないために、開く許可を求めるプロンプトが表示されます。[開く] を選択します。メタデータオーガナイザーアプリケーションがそれぞれのOSで開いたら、ここにファイルをアップロードするか、目的のCellProfiler CSVファイルをドラッグアンドドロップします。
整理ボタンをクリックすると、ファイルのダウンロードボタンで新しい画面にユーザーが表示されます。ボタンをクリックして、出力ファイルを保存する場所を選択します。出力ファイルは、ファイル名に拡張子が追加された元のファイル名_organized表示されます。
FUDRの存在下では、様々な細菌を与えられたワームは、より均一な正確なワーム検出を可能にし、したがって過密の問題を解決する、より一貫した体の大きさを有していた。ワームを凍結すると、バックグラウンド蛍光を排除することでpolyQ凝集体検出が向上し、手動カウントに匹敵する自動カウントの精度が向上しました。反転明視野照明は、polyQ YFP凝集体を画像化するためにC.elegansおよびGFPチャネル全体を検出するために使用した。
各ワームのワーム検出、もつれの解除、および凝集の定量化は、最適化されたCellProfiler画像処理パイプラインを適用して行われ、個々のワームあたりの凝集体数を取得できます。自動凝集定量とCellProfilerパイプラインの使用の有効性の差は最小限であり、自動化された方法を大規模なスクリーンに適用できることを示しています。試験した90の細菌株のうち、1つの候補によるC.elegans腸のコロニー形成は、凝集体の数の有意な減少を示した。
手動計数による確認実験により、凝集体の数を有意に減少させたものを含む変異体のいずれもpolyQ凝集に影響しないことが明らかになった。このフレームワークを使用することを決めた研究者は、概説されている手順が絶対的ではないことを理解する必要があります。CellProfiler の操作方法の変更と基本的な理解は、成功に不可欠です。
ウェスタンブロッティングなどの追加の生化学的アプローチを使用して、polyQ凝集を確認することができます。
