単一細胞または単一核懸濁液を調製することは、高スループットのトランスクリプトームおよびエピゲノムプロファイリングのための重要なステップです。当社のプロトコルは、単一核の単一の分離のための簡単で、再現性、そして普遍的な方法を提供する。核単離に洗剤を必要とする他の方法とは対照的に、私たちのプロトコルは、洗浄剤と酵素フリーであるカラムベースです。
それは30分未満で核の単離を可能にする。私たちのプロトコルは核の分離を簡素化します。これは、解離しにくい組織からの単一の核懸濁液を調製するための堅牢な方法を提供します。
まず、少なくとも30分間氷の上に置くことによって、洗剤を含まない核分離キットからプレチルバッファAとB。5%BSA溶液を用いたチューブとピペットの先端をコーティングし、核の回収を強化します。ピペットの先端をコーティングするには、ピペット5%BSA溶液を2〜3回、空気乾燥2時間乾燥する。
チューブをコーティングするには、BSAでそれらを埋め、それらを3回反転させます。溶液を取り除き、きれいなティッシュペーパーの上でチューブを逆さまに乾かします。1つのサンプルに1つのコレクションチューブと1.5ミリリットルのチューブをコーティングします。
鉗子を使用して頭蓋骨を優しく壊し、頭蓋骨の腹側と後側から柔らかい組織、皮膚、骨を取り除きます。その後、氷冷PBSを含む30ミリメートルの皿に脳をそっと移し、カミソリの刃を使用して脳を小片にミンチします。単一の核を分離するには、核分離キットに用意されているフィルターカートリッジに細かく組織を移し、余分な溶液を取り除き、200マイクロリットルのコールドバッファーAを加え、プラスチック棒で組織を2分間粉砕します。
300マイクロリットルのコールドバッファーAをフィルターカートリッジに加え、キャップを10分間開けた状態で氷の上でインキュベートします。その後、カートリッジをキャップし、チューブを5回反転させることによって組織を再中断します。サンプルチューブを16,000回gで30秒間遠心分離し、細胞を破裂させる。
フロースルーには無傷の核が含まれており、チューブの底に無色ペレットを形成します。フィルターを捨ててから、10秒間激しくボルテックスしてペレットを再中断します。500回gで溶液を3分間遠心して再び核をペレット状にした。
その後、上清を慎重に捨てます。ペレットを0.8ミリリットルのコールドバッファーBに再懸濁させ、2~3回ピペットし、600倍gの核を遠心分離して10分間、膜の破片から分離します。上清を慎重に捨てなさい。
5%BSAでPBSの500マイクロリットルで単離された核を再懸濁し、FACSまで氷の上に懸濁液を保ちます。HEX染色で核形態を確認するには、BSAコーティングされた先端を使用して、単核懸濁液の100マイクロリットルを新しいチューブに移します。0.1マイクロリットルのHEXを加え、チューブを穏やかに渦液にすることによって核を染色する。
405ナノメートルのレーザー励起設定を用いた蛍光顕微鏡を使用して、核懸濁液をガラス底皿に移し、核の画像を画像化します。FACS を実行する前に、40 マイクロメートルの細胞ストレーナーを用いて、BSA コーティングチューブに核をフィルターします。5%BSAのPBSを加えて、1,000マイクロリットルの最終容量にフィルターした懸濁液を希釈します。
コントロールとして2つの丸底FACSチューブをラベル付けし、染色し、BSAコーティングされたピペットチップを使用してコントロールチューブに核懸濁液の250マイクロリットルを移します。残りの750マイクロリットルの溶液を染色とラベル付けされたFACSチューブに移し、1マイクロリットルのHEX染料を加えて核を染色する。その後、ゆっくりと渦を混ぜます。
未染色のコントロール サンプルをセルソーターに読み込み、5,000 個のイベントを記録します。次に、染色されたサンプルをロードし、5,000のイベントを記録します。単一の核の識別のためのFACSゲートを描く。
核は、コントロールと染色されたサンプルの間でHEX蛍光シグナルを比較することによって選択することができる。その後、5%BSAで50マイクロリットルのPBSを含む新しい1.5ミリリットルチューブに染色チューブからHEX陽性核を選別します。このプロトコルは、ゼブラフィッシュの脳組織から直接単一核懸濁液を生成するために使用された。
単離された核をHEXで染色し、蛍光顕微鏡で可視化した。彼らは無傷で、丸く、よく離れているように見えました。重要なことに、核凝集は欠かれていた。
単離された核の濃縮は、HEX蛍光シグナルの存在下で格子を行うことによってフローサイトメトリーで行った。染色されていない核は、強い蛍光シグナルを示しながら、背景蛍光を示した。染色されていない核は、紫色チャネルで十分に分離した。
このプロトコルを試みる間、単一の核はプラスチック材料に固執する傾向があることを覚えておくことが重要です。核の潜在的な損失を防ぎ、効率を高めるために、プラスチック材料の基本的なコーティングが強く推奨されます。単一核懸濁液は、単一核RNAにさらに利用することができ、この技術は、複雑な生物学的システムにおける細胞の不均一性を解明し、細胞サブタイプおよび遺伝子ネットワークを定義するのに役立つ。
洗浄剤と酵素を使用する方法を使用して、サンプル調製中に導入された技術的なノイズとバイアスを登録します。この方法は、単純化された、ロジスティックな単一核の分離を開発した。
