Tek bir hücre veya tek çekirdek süspansiyonhazırlanması yüksek iş transkripsiyon ve epigenom profilleme için kritik bir adımdır. Protokolümüz tek çekirdek izolasyonu için basit, tekrarlanabilir ve evrensel bir yöntem sağlar. Çekirdek izolasyonu için deterjan gerektiren diğer yöntemlerin aksine, protokolümüz kolon bazlıdır, bu deterjan ve enzim içermez.
30 dakikadan daha kısa sürede çekirdek izolasyonu sağlar. Protokolümüz çekirdek izolasyonuna basitleştirir. Bu zor-dissociate dokulardan tek çekirdek süspansiyon hazırlamak için sağlam bir yöntem sağlar.
Başlamak için, deterjansız çekirdek izolasyon kitinden önceden soğutan tampon A ve B, en az 30 dakika buzüzerinde yerleştirin. Kap tüpleri ve pipet uçları ile 5% BSA çözeltisi, hangi çekirdeklerin kurtarma artıracaktır. Pipet uçlarını kaplamak için pipet %5 BSA çözeltisi 2-3 kez ve hava yla iki saat kurutun.
Tüpleri kaplamak için, BSA ile doldurun ve üç kez ters çevirin. Çözeltiyi çıkarın ve tüpleri iki saat boyunca temiz bir kağıt üzerinde baş aşağı kurulayın. Coat bir toplama tüpü ve örnek başına bir 1,5 mililitrelik tüp.
Kafatasını nazikçe açmak ve yumuşak dokuları, deriyi ve kemikleri kafatasının ventral ve dorsal kenarlarından çıkarmak için forceps kullanın. Sonra yavaşça buz gibi PBS içeren 30 milimetrelik bir çanak içine beyin aktarın ve bir jilet kullanarak küçük parçalar halinde beyin kıyma. Tek çekirdekleri izole etmek için, çekirdek izolasyon kitinde sağlanan filtre kartuşuna kıyma dokusunu aktarın ve fazla çözeltiyi çıkarın ve 200 mikrolitre soğuk tampon ekleyin A.Grind iki dakika boyunca plastik çubukla dokuyu öğütün.
Filtre kartuşu için 300 mikrolitre soğuk tampon A ekleyin ve kapağı 10 dakika açık buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Daha sonra kartuşun kapağını kapatın ve tüpü beş kez ters çevirerek dokuyu yeniden askıya alın. Hücreleri yırtmak için örnek tüpü 16,000 kez 30 saniye boyunca santrifüj edin.
Akış-through tüp altında renksiz bir pelet oluşturan bozulmamış çekirdekleri içerir. Filtreyi atın ve sonra 10 saniye boyunca şiddetle girdap yaparak peleti yeniden askıya alın. Çözeltiyi 500 kez g'de üç dakika santrifüj ederek çekirdekleri tekrar peletleyin.
Sonra dikkatle supernatant atın. Peleti 0,8 mililitre soğuk tampon B'de 2-3 kez borulandırarak yeniden askıya alın ve çekirdekleri 600 kez g'de 10 dakika santrifüj edin, bu da onları membran enkazından ayıracaktır. Supernatant'ı dikkatlice atın.
500 mikrolitre PBS'deki izole çekirdekleri %5 BSA ile yeniden askıya alın ve facs'a kadar süspansiyonu buzda tutun. HEX boyama ile nükleer morfolojiyi doğrulamak için, BSA kaplı uçlar kullanarak tek çekirdek süspansiyonunun 100 mikrolitresini yeni bir tüpe aktarın. 0,1 mikrolitre HEX ekleyerek ve tüpü yavaşça girdaplayarak çekirdekleri lekelayın.
405 nanometrelik lazer uyarma ayarı ile floresan mikroskobu kullanarak çekirdek süspansiyonu cam bir alt çanağa ve çekirdeğin görüntüsüne aktarın. FACS yapmadan önce, 40 mikrometrelik hücresüzü bsa kaplı bir tüpe süzün. Filtrelenmiş süspansiyonu % 5 BSA ile 1.000 mikrolitrelik son hacmine PBS ekleyerek seyreltin.
Kontrol ve lekeli olarak iki yuvarlak alt FACS tüpleretiket ve bir BSA kaplı pipet ucu kullanarak kontrol tüpü içine çekirdek süspansiyon 250 mikrolitre aktarın. Çözeltinin kalan 750 mikrolitresini lekeli etiketli FACS tüpüne aktarın ve çekirdekleri lekelemek için bir mikrolitre HEX boya ekleyin. Sonra yavaş girdap tarafından karıştırın.
Lekesiz kontrol örneğini hücre ayırıcısına yükleyin ve 5.000 olay kaydedin. Sonra lekeli örnek yük ve 5,000 olaylar kaydedin. Tek çekirdeklerin tanımlanması için FACS kapılarını çizin.
Çekirdekler, HEX floresan sinyalinin kontrol ve lekeli numuneler arasında karşılaştırılarak seçilebilir. Daha sonra, lekeli tüpten HEX pozitif çekirdekleri 50 mikrolitre PBS içeren ve %5 BSA içeren 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe sıralayın. Bu protokol doğrudan zebra balığı beyin dokusundan tek çekirdek süspansiyonu oluşturmak için kullanıldı.
İzole çekirdekleri HEX ile boyandı ve floresan mikroskopisi ile görselleştirildi. Onlar bozulmamış, yuvarlak ve iyi ayrılmış görünüyordu. Daha da önemlisi, nükleer toplama yoktu.
İzole çekirdeklerin zenginleştirilmesi, hex floresan sinyalinin varlığı üzerine gating edilerek akış sitometrisi ile gerçekleştirildi. Lekesiz çekirdekler arka plan floresan ını sergilerken, lekeli çekirdekler güçlü floresan sinyali sergiledi. Lekesiz ve lekeli çekirdekler menekşe kanalında iyi ayrılmıştı.
Bu protokolü denerken, tek çekirdeklerin plastik bir malzemeye yapışma eğiliminde olduğunu hatırlamak önemlidir. Çekirdeklerin potansiyel kaybını önlemek ve verimliliği artırmak için, plastik malzemenin temel kaplaması şiddetle tavsiye edilir. İzole tek çekirdekli süspansiyon daha tek çekirdekli RNA için kullanılabilir Bu teknik karmaşık biyolojik sistemlerde hücresel heterojenite açıklığa kavuşturabilir ve hücre alt tipleri ve gen ağlarının tanımlanmasına yardımcı olur.
Deterjan ve enzimsiz bir yöntem kullanmak, numune hazırlama sırasında ortaya çıkan teknik gürültü ve önyargıyı kaydeder. Bu yöntem basitleştirilmiş ve lojistik tek çekirdek izolasyonu geliştirmiştir.
