La preparazione di una sospensione a singola cellula o a singolo nucleo è un passaggio critico per il trascrittame ad alta produttività e la profilazione dell'epigenoma. Il nostro protocollo fornisce un metodo semplice, riproducibile e universale per l'isolamento di singoli nuclei. Contrariamente ad altri metodi che richiedono detersivo per l'isolamento dei nuclei, il nostro protocollo è a base di colonna, che è privo di detergenti ed enzimi.
Consente l'isolamento dei nuclei in meno di 30 minuti. Il nostro protocollo semplifica l'isolamento dei nuclei. Fornisce un metodo robusto per preparare la sospensione di singoli nuclei da tessuti difficili da dissociare.
Per iniziare, tampone pre-freddo A e B da un kit di isolamento dei nuclei privo di detergenti posizionandoli sul ghiaccio per almeno 30 minuti. Tubi di rivestimento e punte di pipetta con soluzione 5%BSA, che migliorerà il recupero dei nuclei. Per rivestire le punte delle pipette, pipettare la soluzione 5%BSA due o tre volte e asciugarle ad aria per due ore.
Per rivestire i tubi, riempirli di BSA e invertirli tre volte. Rimuovere la soluzione e asciugare ad aria i tubi capovolti su una carta velina pulita per due ore. Rivestire un tubo di raccolta e un tubo da 1,5 millilitri per campione.
Usa le fasci per aprire delicatamente il cranio e rimuovere tessuti molli, pelle e ossa dai lati ventrale e dorsale del cranio. Quindi trasferire delicatamente il cervello in un piatto da 30 millimetri contenente PBS ghiacciato e tritare il cervello in piccoli pezzi usando una lama di rasoio. Per isolare singoli nuclei, trasferire il tessuto tritato nella cartuccia di filtro fornita nel kit di isolamento dei nuclei e rimuovere la soluzione in eccesso e aggiungere 200 microlitri di tampone freddo A.Macinare il tessuto con un'asta di plastica per due minuti.
Aggiungere 300 microlitri di tampone freddo A alla cartuccia del filtro e incubarlo sul ghiaccio con il tappo aperto per 10 minuti. Quindi capovolgi la cartuccia e rimospendi il tessuto invertendo il tubo cinque volte. Centrifugare il tubo campione a 16.000 volte g per 30 secondi per rompono le cellule.
Il flusso contiene nuclei intatti, che formano un pellet incolore nella parte inferiore del tubo. Scartare il filtro e quindi rimescolare il pellet vortice vigorosamente per 10 secondi. Pellettare nuovamente i nuclei centrifugando la soluzione a 500 volte g per tre minuti.
Quindi scartare con cura il supernatante. Resostigliere il pellet in 0,8 millilitri di tampone freddo B pipettando da due a tre volte e centrifugando i nuclei a 600 volte g per 10 minuti, il che li separerà dai detriti della membrana. Scartare con cura il supernatante.
Riprendono i nuclei isolati in 500 microlitri di PBS con 5%BSA e mantieni la sospensione sul ghiaccio fino al FACS. Per confermare la morfologia nucleare con la colorazione HEX, trasferire 100 microlitri della sospensione a singolo nucleo su un nuovo tubo utilizzando le punte rivestite BSA. Macchiare i nuclei aggiungendo 0,1 microliter di HEX e vortice delicatamente del tubo.
Trasferire la sospensione dei nuclei su un piatto inferiore di vetro e l'immagine dei nuclei utilizzando un microscopio a fluorescenza con un'impostazione di eccitazione laser di 405 nanometri. Prima di eseguire FACS, filtrare i nuclei con un filtro cellulare da 40 micrometri in un tubo rivestito di BSA. Diluire la sospensione filtrata aggiungendo PBS con 5%BSA a un volume finale di 1.000 microlitri.
Etichettare due tubi FACS inferiori rotondi come controllo e macchiare e trasferire 250 microlitri delle sospensioni dei nuclei nel tubo di controllo utilizzando una punta di pipetta rivestita BSA. Trasferire i restanti 750 microlitri della soluzione sul tubo FACS etichettato macchiato e aggiungere un microlitro di colorante HEX per macchiare i nuclei. Quindi mescolarlo con un vortice lento.
Caricare l'esempio di controllo non contenuto nell'ordinamento delle celle e registrare 5.000 eventi. Quindi caricare il campione macchiato e registrare 5.000 eventi. Disegnare cancelli FACS per l'identificazione di singoli nuclei.
I nuclei possono essere selezionati confrontando il segnale fluorescente HEX tra il controllo e i campioni macchiati. Quindi ordinare i nuclei positivi HEX dal tubo colorato in un nuovo tubo da 1,5 millilitri contenente 50 microlitri di PBS con 5%BSA. Questo protocollo è stato utilizzato per generare una sospensione a nucleo singolo direttamente dal tessuto cerebrale zebrafish.
I nuclei isolati sono stati macchiati con HEX e visualizzati con microscopia a fluorescenza. Sono apparsi intatti, rotondi e ben separati. È importante sottolineare che l'aggregazione nucleare era assente.
L'arricchimento di nuclei isolati è stato eseguito con citometria a flusso gating sulla presenza di un segnale fluorescente HEX. I nuclei non macchiati mostravano fluorescenza di fondo mentre i nuclei macchiati mostravano un forte segnale di fluorescenza. I nuclei incontaminati e macchiati erano ben segregati nel canale viola.
Durante il tentativo di questo protocollo, è importante ricordare che i singoli nuclei tendono ad attaccarsi su un materiale plastico. Per prevenire la potenziale perdita di nuclei e aumentare l'efficienza, si consiglia vivamente il rivestimento di base del materiale plastico. La sospensione isolata di singoli nuclei può essere ulteriormente utilizzata per l'RNA a nuclei singoli Questa tecnica elucida l'eterogeneità cellulare in sistemi biologici complessi e aiuta a definire sottotipi cellulari e reti geniche.
L'uso di un detergente e di un metodo privo di enzimi registra il rumore tecnico e la distorsione introdotti durante la preparazione del campione. Questo metodo ha sviluppato un isolamento semplificato e logistico di singoli nuclei.
