このプロトコルは、組織学的解析を使用して、マウスの切除創傷の堅牢な形態測定を得る。この手法を使用して、連続セクションのサブセットを使用して創傷全体を分析することができ、そうでなければ見逃される可能性のある欠陥をより正確に検出することができます。この手順を実証することは、私の研究室の研究員であるリンジー・リアです。
麻酔をかけた大人のマウスでペダル反射に対する応答の欠如を確認した後、動物の目に軟膏を適用し、肩のレベルでマウスの背面の毛皮を取り除くために尾頭-rostral運動で電気カミソリのクリッパーを使用します。露出した皮膚から残りの毛を取り除くために、背中から20度の角度で保持されたカミソリの刃を使用して、露出した皮膚から残りの毛を取り除き、1つのポビドンヨウ素と1つの70%イソプロピルアルコール準備パッドワイプで皮膚をきれいにします。創傷誘導の場合は、清潔なペーパーベースのタオルを歯科ワックスで覆われた平らな表面にドレープし、マウスを起こしやすい位置のタオルの上に置きます。
背部の正中線に沿って肩甲骨の間にマウスの皮膚をつまみ、サンドイッチした皮膚を体から引き離します。マウスを横に置く位置に切り替え、必要な創傷サイズの生検パンチをできるだけ体の近くに置き、皮膚をリラックスさせます。ロッキングモーションを使用してパンチを押し下げて皮膚のすべての層を穿刺し、必要に応じて周囲の皮膚からパンチを解放するために、滅菌ハサミとピンセットを使用して傷口からパンチ生検を取り除きます。
その後、マウスがモニタリングと鎮痛で回復することを許可します。創傷床の形態測定解析のために、デジタル染色された創傷画像を開く。スケールと計測の設定を設定するには、[分析]で[スケールを設定]を選択し、距離をピクセル単位で指定し、距離を既知の距離と長さの単位で入力します。
[グローバル]および[OK]を選択して、開いている画像ごとに尺度を同じに保ち、[解析]と[測定を設定]を選択して、領域ボックスがオンになっていることを確認します。創傷の長さを測定するには、フリーハンドを選択し、傷の片側の傷のない組織の最後の毛包から反対側の傷害されていない組織の最初の毛包まで、真皮表皮接合部に沿ってトレースするツールを使用します。表皮が創傷全体を覆わない場合は、移動する舌が終わる創傷の片側の真皮表皮接合部に従い、顆粒組織の優れた態様または顆粒組織とかさぶたの間の接合に従い続け、舌が移動し、傷の反対側の最初の毛包が達するまで続ける。
次に、[分析と測定] をクリックします。計測の長さは、スケールで設定した単位と同じ単位で表示されます。表皮が創傷全体を覆わない場合は、造粒組織の優れた側面または肉芽組織と最初の毛包との間の接合部に従って、各表皮のリーディングエッジ間の距離を測定する。
創傷領域を測定するには、フリーハンドツールを使用して、表皮の優れた側面または創傷の片側の傷害されていない組織の最後の毛包から他方の側の傷害されていない組織の最初の毛包まで始まる顆粒組織の優れた側面に沿ってトレースする。毛包に沿って顆粒組織に垂直にトレースを続けます。反対側の毛包と脂肪組織または筋肉に達したら、顆粒組織の下の境界に従って創傷の反対側に、毛包に沿って開始点を結合して領域を閉じる。
創傷が完全に上皮化されていない場合は、表皮の優れた側面に沿って、リーディングエッジまでトレースし、真皮表皮接合部に続く出発点に戻ります。図示したように、創傷全体を通して2D測定を行う場合、現場で一般的に使用される方法である創傷の真ん中でのみ2D解析では不可能なパラメータを計算することができました。この実験では、創傷領域の2D測定を使用し、創傷全体または創傷の中間サブセットにわたって平均化し、実験群または分析方法との間に有意な差を明らかにされなかった。
しかし、計算された創傷容積は実験群間で有意に異なっていたため、創傷治癒パラメータの詳細な組織学的分析の重要性が示された。組織学的解析のために一貫してサイズの大きさの創傷を生成し、厳密な連続断面化を行うことは、正確な形態測定解析にとって重要です。染色されていない切片は、免疫蛍光またはマッソンのトリクローム染色に使用して創傷治癒の他の側面を測定し、フラッシュ凍結創傷は定量的タンパク質分析のためにモルファメトリーと一緒に使用することができます。
