再生医療では、特定の神経細胞型に対する多能性幹細胞の分化という強固なプロトコルが貴重なツールです。我々の場合、このプロトコルは、神経膠芽腫の発症とパーキンソン病の両方を研究するのに非常に有用であった。そこで第一に、三次元オルガノイドの生成は、生理的発達を密接に模倣する利点を有し、また、多能性幹細胞からのサイズ較正された神経球の産生は、高い再現性を有する。
以下の手順は、私たちの研究室の博士課程の学生であるマノン・ロカテリによって実証されます。3D培養を開始する24時間前に、hESC培地を10-ミクロモルROCK阻害剤を添加した無血清培地に置き換える。細胞は60%の合流度であるべきである。
翌日、培地を除去し、カルシウムとマグネシウムフリーPBSでリンスすることにより、単一細胞としてhESCコロニーを脱離する。その後、酵素溶解溶液を5ミリリットル加え、摂氏37度で1~2分間インキュベートします。その後、10マイクロモルROCK阻害剤で無血清培地に細胞を採取し、300倍gで5分間遠心分離します。
遠心分離後、細胞ペレットの大きさを確認します。上清を取り除き、10マイクロモルロック阻害剤を添加した無血清培地の10ミリリットルの細胞を数えます。並行して、マイクロウェルプレートをウェルあたり2ミリリットルの無血清培地でリンスし、遠心分離機でプレートを1,200倍gで5分間リンスし、神経圏形成を防ぐためにすべての気泡を除去する。
次に、10マイクロモルロック阻害剤を添加した無血清培地12.5ミリリットルで2,820万個の細胞を調製する。マイクロウェルあたり1,000個の細胞を分配する。5分間gの300倍で細胞を遠心分離し、顕微鏡下でマイクロウェルプレート内の細胞の均質な再分配を確認する。
プレートをインキュベーターに一晩摂氏37度に置きます。翌日、マイクロウェルプレートを調べて、各マイクロウェルに形成された球体の大きさを確認します。高速神経誘導を促進するためにデュアルSMAD阻害カクテルを補充した培地を使用して、球体を6ウェルプレートに移します。
このステップから、球体は60rpmで回転して培養され、それらが一緒に、またはプレートに付着するのを防ぎます。1日目から4日目には、神経誘導を行う前に2〜3日ごとに培地を交換します。4日目から11日目まで、デュアルSMADカクテルを添加したB27培地に1ミリリットル当たり10ナノグラムでEGFとbFGFを添加することにより、hESC由来のニューラルロゼットの増殖を促進する。
11日目から13日目まで、0.5マイクロモルBMP阻害剤を添加したB27培地中の球体を培養する。13日目から21日目まで、GDNFおよびBDNFを添加したB27培地中の球体を1ミリリットル当たり10ナノグラム及び1マイクロモルガンマセクレターゼ阻害剤で培養する。21日目に、新しい6ウェルプレートの1つの井戸に1つの培養プレートインサートを置きます。
その後、膜挿入物の下の各ウェルに成長因子と阻害剤を添加したB27培地の1ミリリットルを追加します。続いて、培養プレートに堆積した親水性PTFE膜に球体をプレートし、次の3週間分化のために2〜3日ごとに培地を交換する。このステップから回転を停止します。
ロゼットの存在は、神経分化の開始を示す。21日目から25日目まで、同じ神経成熟培地でヒト神経オルガノイドを培養する。次いで、25日目から28日目まで、1つのマイクロモルガンマセクレターゼ阻害剤を有するB27培地のみを補体する。
28日目から39日目まで、ガンマ・セクレターゼ阻害剤の添加を中止し、B27培地のみでヒト神経オルガノイド培養を継続する。3週間後、神経オルガノイドはGIC移植に使用する準備ができています。ゼロ日には、2次元培養で60%の合流度までhESCを増幅します。
次に、hESCの多能性を維持するために使用される幹細胞培地を、次の日の通過中に細胞の生存率を高めるために、デュアルSMAD阻害カクテルを含む無血清培地に置き換え、神経誘導を開始し、10マイクロモルロック阻害剤を使用する。1日目に、同じ濃度のROCK阻害剤とデュアルSMAD阻害分子を含む無血清培地のウェルあたり2.5ミリリットルのマイクロウェルプレートを準備します。神経管腹側パターンに向かって細胞を分化するには、SHHとFGF8を1ミリリットル当たり100ナノグラムで追加し、2つのマイクロモルを滑らかにしたアゴニストを加える。
培地を添加した後、プレートを1、200回gで5分間遠心し、マイクロウェルから気泡を取り除く。マイクロウェルプレートを半分の分化媒体で使用する準備ができたら、hESCの培地を取り除き、カルシウムと塩化マグネシウムを含まないPBSで素早く洗浄します。T75フラスコに7.5ミリリットルの組換え酵素溶液を加えて、コロニーを単細胞懸濁液に解き分ける。
37°Cで2分間細胞をインキュベートし、DMEM F12の7.5ミリリットルを追加します。続いて、細胞懸濁液と遠心分離機を300回gで5分間回収する。次に、上清を取り除き、マイクロウェルプレートを調製するために使用したのと同じ培地内の細胞を数える。
培地容量を調整して、2.5ミリリットルの培地で470万個の細胞を調製し、プレートに既に配置されている培地の前の2.5ミリリットルに添加することによって、マイクロウェルあたり1,000個の細胞を含む神経球を形成できるように細胞懸濁液を得るように調整します。各マイクロウェルの細胞を正しく分配するために、プレートを軽く振り、300倍gで5分間遠心分離します。次に、プレートを24時間摂氏37度でインキュベートし、球体を生成します。
2日目には、マイクロウェルをミディアムで静かに洗い流し、組織処理された6ウェルプレートで球を移します。球体を摂氏37度で回転させ、2~3日ごとに新鮮な培地で半分の培地を交換します。3日目から13日目に、神経誘導を増強し、中脳同一性を持つ神経前駆物質に変換するために、3マイクロモルGSK-3-β阻害剤で培地を補う。
球密度を下げ、球体の凝集を避けるために、サンプルを2つの新しい組織処理された6ウェルプレートに分割します。8日目には、成長因子を持つ新しい培地に切り替えて神経成熟を開始し、2〜3日ごとに培地を変更します。21日目に、新しい6ウェルプレートの1つの井戸に1つの培養プレートインサートを配置し、膜インサートの下に神経圏分化に使用される神経成熟培地の1.2ミリリットルを追加します。
次いで、培養プレートインサート上にPTFE膜を脱液する。最後に、神経オルガノイドを生成するために、PTFE膜上の空気液体界面条件下で約100の神経球を播種する。このステップから回転を停止し、必要な分化時間が達成されるまで2~3日ごとに培地を交換します。
ドーパミン作動性神経オルガノイドの生成のための標準化されたプロトコルの概略図を次に示します。これらの画像に示されているドーパミン作動性神経オルガノイドの免疫蛍光分析は、中脳特異的マーカーであるNurr1を共発現させるTH免疫反応性細胞を示す。これら2つのグラフは、定量的RT-PCRにより評価されたTHおよびNurr1遺伝子発現の動態を表す。
MEA プラットフォームで記録された生データの例を次に示します。各スパイクは垂直線で表示され、残りのトレースはノイズです。そして、この写真はMEAに堆積した神経球を表しています。
これらのグラフは、生データから検出された典型的なスパイクの重ね合わせを示しています。黒い太字の曲線は、対応する赤い曲線の平均を示します。このラスター プロットは、検出された各スパイクに関連付けられたタイムスタンプを示します。
異なる色は異なった電極を強調する。このプロトコルは、研究者が神経オルガノイドとの癌細胞相互作用に関する質問に答えるだけでなく、ドーパミン作動性オルガノイドとの直接スクリーニングを可能にする。
