この方法は、タンパク質の確認とタンパク質相互作用の測定を容易にします。バッファー組成物、サンプルの純度およびタンパク質濃度の要件は、困難な構造上の問題に対処する方法を可能にする柔軟です。この手法により、多種多様な異なるバッファー システムでサンプルを圧縮できます。
私たちのドシメトリー法を使用して、研究者はラベリング反応がリアルタイムでどれだけうまく機能しているかを監視することができます。この技術の1つのアプリケーションは、研究者が広く異なる薬物製剤をテストし、それらがタンパク質構造にどのような影響を与えるかをテストすることができるので、医薬品開発にあります。FPOP 光ベンチを準備します。
まずレーザーをオンにし、外部トリガ、一定エネルギー、ガス交換なしにレーザーを設定します。レーザーが温まった場合、パルス当たりのレーザーエネルギーをパルスあたり80〜120ミリグラムに設定し、ブタントーチを使用して、インライン線量計がレーザー暴露後に265ナノメートルで吸収信号を読み取る場所で毛細管のポリイミドコーディングを穏やかに燃焼させます。糸くず拭き取りとメタノールを使用して毛細血管から残骸を静かに拭き取り、洗浄した毛細管をレーザーのビームパスを通ってインライン線量計に入れる。
インライン線量計の上部にあるレバーを押してヒンジを開き、磁気ホルダーを取り外します。磁気ホルダーを使用してインライン線量体の機械溝にキャピラリーを置き、キャピラリーを所定の位置に保ち、レバーが所定の位置にロックされるまでヒンジを押すキャピラリーの上に線量計ヒンジを閉じます。ドシメトリーソフトウェアの開始フラッシュボタンをクリックしてエキシマレーザーの発射を開始し、レーザー発射で線量測定ソフトウェアの10〜20ヘルツの間でプリセットの繰り返しレートを設定すると、その動きの範囲を通して電動ステージが移動し、ビームがアパーチャーの中心にとどまり、キャピラーのシルエットを全体に観察することができます。
次に、キャピラリーを1分間20マイクロリットル/分で水で洗い流し、データ収集を開始する前に、ドーシメータソフトウェアの開始データと自動ゼロをクリックして、水に対するドーシメータをゼロにします。FPOP実験を行うため、過酸化水素を2マイクロリットルのFPOP溶液に加え、ピペットを使用して、チューブ底部の溶液を遠心分離で素早く回収し、ガスタイトな注射器を使用して溶液をシリンジポンプにロードします。スキャン・ポンプを開始して、適切な流量でシリンジポンプの流れを開始し、265ナノメートルの吸収信号が廃棄物容器内のサンプルを集めるのが安定するまで、インライン線量計を使用してリアルタイムのアデニン読み取りを監視します。
あらかじめ設定された繰り返し速度の終了エネルギーでレーザーの発射を開始するには、線量計ソフトウェアの開始フラッシュボタンをクリックし、インライン線量計を使用してリアルタイムのアデニン読み取りを監視します。レーザーをオフにしてレーザーをオンにした265ナノメートルの吸光度の違いは、265ナノメートルの読み取り値でデルタ吸収剤になります。同等のヒドロキシルラジカルが異なるサンプル間のタンパク質と反応できることを確認します。
インライン線量計で得られた265ナノメートルの測定値でデルタ吸収剤を、以前の実験または制御から得られた265ナノメートルの読み取り値での欲望デルタ吸収剤と比較します。読み取り値が所望のレベルにある場合は、レーザーまたは放射線の直後に、クエンチバッファー内のサンプルを収集します。吸光度を等しくするために有効なラジカル線量を補償するために、過酸化水素濃度を変化させ、パルス当たりのレーザーエネルギーを変化させるか、または焦点レンズの焦点面を変更してレーザーのフルエンスを増加させる。
デルタ吸収剤の10ミリを超える吸収単位の変化を作るために読み取り多かれ少な過酸化水素でサンプルを作り直し、実証したようにサンプルを再実行します。吸光度の読み取り値をリアルタイムで小さく変更するには、50ミリメートルの電動ステージを使用して、集光レンズの位置を調整して、入射ビームの焦点面を調整します。レーザー照射後に試料中に存在するヒドロキシルラジカルの有効量を測定するために、265ナノメートルの測定値でデルタ吸収物質が所望の読み取り値に等しくなるまで、電動ステージを用いて、265ナノメートルでアデニンデルタ吸収剤をリアルタイムで265ナノメートルで監視し、レンズ位置を調整した。
リン酸緩衝液中のアビシウマブの重鎖ペプチドフットプリントと摂氏55度で1時間加熱した後の比較は、示されたペプチド領域が、タンパク質が加熱されて凝集体を形成する際に溶媒からの有意な保護を示すことを明らかにした。レーザーまたは放射線の前後にアデニン吸収剤の差を監視するためにリアルタイムでインライン線量計を使用すると、リン酸緩衝液と比較してMESバッファーにおいて、アデニン吸収剤レベルの同等の変化が観察されることを示す。ペプチドの平均酸化はリン酸緩衝液と比較してMESバッファーの存在下で低い。
しかしながら、レーザフルエンスが増加するにつれて、平均ペプチド酸化値はFPOPおよびMES緩衝液およびリン酸緩衝液後にほぼ同じである。このドシメトリーの読み取り値としては、レージスカベンジャーと同様にレーザーフルエンス過酸化物濃度の影響を受ける。サンプル調査間の間のドシメトリー応答が互いに近いということに注意してください。
サイト指向変異誘発は、FPOPで保護された部位を調査するためにしばしば使用される。これにより、研究者は変更がアリスターによるものかどうかを判断することができます。この技術は、異なるバッファーまたは製剤中のタンパク質の比較を容易にし、研究者がタンパク質の確認に対する異なる添加剤の効果を決定することを可能にする。
