MAM、FS、MGMはNIEHS(プロジェクト4、P42ES027704、PI、ルシン)によって資金提供されています。MAM、FS、RMM、MGM、PKSは、CPRITが資金を提供するGCC先端顕微鏡・画像情報学センター(RP170719)によってサポートされています。イメージングは、NIH(DK56338、CA125123)、CPRIT(RP150578)、ダン・L・ダンカン総合がんセンター、ジョン・S・ダン・ガルフ・コースト化学ゲノミクス・コンソーシアムからの資金提供を受けて、ベイラー医科大学の統合顕微鏡コアによってもサポートされています。

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著者らは開示するものは何もない。

記載されている smFISH の方法論は、以前に公開されたプロトコル7、12、14に基づいています。このプロトコルでは、ウェットラボ(播種密度、固定時間、透過性、プローブ濃度を含む)からイメージングおよび画像解析に最適化された重要なステップを説明し、遺伝子転写の単一細胞分析を行うことに興味を持つ研究所に完全な実験パイプラインを提供します。
単一細胞分析を容易にするためには、細胞境界を必要とせずに細胞境界が推定されるように、細胞がサブコンフルエントであり、重なり合わないことが重要です。実験期間中、広範囲の播種密度に及ぶ細胞増殖アッセイを完成させ、細胞密度を最適化することを提案します。
smFISH実験を成功させるには、最適な固定時間を決定することが重要です。我々は、VRCを含む滅菌PBSで氷上で30分間希釈した4%精製ホルムアルデヒドでサンプルを固定し、特に目的の因子に対する抗体の組み合わせを介して構造解析が必要な場合に、高品質のsmFISH画像の一貫性を大幅に向上させることがわかりました。ホルムアルデヒドは、架橋性高分子によってサンプルを固定し、有機溶媒25を採用するもののような他の固定法よりも細胞構造をより良く維持することができる。しかしながら、試料26を過大または過少固定することを避けるためには、特定のサンプルに対して固定時間および温度の調整が必要である。VRCはRNA分解を低減し、特に低い豊富なRNA27に有用であるため有用である。パーメアビライゼーションのステップで成功した2つのオプションがあります。1つ目は4°Cで70%エタノールインキュベート、2つ目は室温7、14で0.5%のトリトンX100インキュベーションである。イメージング対応のガラス底マルチウェルプレート(96および384ウェル)を使用して、同じプロトコルを高スループットで実行することができます。smFISHを実行する際の一貫した成功は、VRCを含む固定剤を使用したガラスマルチウェルプレートの使用、およびパーメアビライゼーションステップのためのVRCとの0.5%Triton-X 100の使用に依存していました。光学プラスチック底板はオプションですが、画質と成功は著しく低くなっています。
単一セル解析では、バックグラウンド信号や偽陽性をフィルタリングし、回折制限スポットを正しく識別するには、高い信号対雑音比が必要です。背景信号は、対象の信号の強度値に追加されます。高い背景は、最適でない実験計画から生じることが多く、蛍光強度測定から差し引かれるが、最初は、できるだけ少ないバックグラウンド信号で対象領域を画像化するのが最善である28。信号が対象の背景または関心の信号と見なされるかどうかを判断するには、最小〜10倍の差を持つ高いダイナミックレンジが必要です。偽陽性スポットは、細胞境界外に存在するシグナルを指し、しばしば、十分に洗浄されていないカバーリップ、ハイブリダイゼーション後の洗浄が不十分、またはプローブが自己関連付け30のときに発生するプローブ凝集に起因する。標的とは異なるRNAに対するオリゴセットのスプリアス結合による非特異的シグナルが起こった場合(すなわち、疑似遺伝子または配列類似性のために)、これらは関心のある遺伝子を発現しないモデル(すなわち、ノックアウトMEF、CRISPR/Cas9ノックアウト)31でプローブセットをテストすることによって評価することができる。さらに、蛍光顕微鏡実験と同様に、イントロンプローブとエキソンプローブはスペクトル分離する必要があります。実験例では、GREB1プローブセットにAtto 647NおよびQuasar 570色素を使用した場合、使用する顕微鏡上のフィルタセットの仕様に適合し、光漂白に耐性があり、量子収率が比較的高い8、14、32を有するため、このセットを選択しました。サンプルに応じて、各プローブセットに最適な信号対雑音比を特定するために、ストックプローブの希釈シリーズ(通常は1:200~1:1000希釈、または12.5 nM~62.5 nM)を作成することをお勧めします。一部のベンダーは、ユーザーが選択したフルオロフォアを使用してカスタム標識プローブを提供して、明るさを高め、光漂白を低減し、必要に応じて、ほとんどの現代の蛍光顕微鏡7、8、14で一般に利用可能な1〜2チャンネルを追加します。smFISHは低容量のRNAを測定する能力を持っていますが、重要な問題は、特に組織サンプルの場合、部分的に分解されたRNAを検出する感度と能力を高めることです。シグナルを増幅するように設計された分岐DNAプローブを使用することで、より高いシグナル対雑音比を達成することは可能であるが、我々はこのアプローチが我々の研究33に有用であることを発見していない。共焦点顕微鏡は、焦点を合わせる光源を使用してサンプルを照らしながら、ピンホールを 1 つ以上のピンホールで検出器に到達するフォーカス外の光を遮断します。プローブはレーザー照明からより速く光化するため、ポイントスキャン共焦点顕微鏡は一般的にRNA-FISHイメージングでは推奨されません。しかし、試料と信号強度に応じて、共焦点顕微鏡は信号損失8をほとんどまたは全く有しない画像を生成することができる。ここでは、FISHプローブ34から放出される光子の最大数を収集するために、高い倍率および高い開口率の目的を有する広視野蛍光顕微鏡を利用した。zスタックの隣接する平面からの焦点外光によって画像がぼやける可能性があるが、修復デコンボリューションアルゴリズムは、取得したzスタック間の回折光を原点34に計算的に「再割り当て」するために適用される。これにより、画像解析用の最終的な高解像度画像が生成されます。可能であれば、実験28に最適なシステムを決定するために、異なるイメージングモダリティを経験的に比較するのが最善でしょう。
smFISHの多くの可能な拡張とアプリケーションがあります。モデル実験では、GREB1遺伝子のプローブを1セットずつ用いてハイブリダイゼーションを1ラウンド完了しました。しかし、smFISHの数ラウンドを順次(seqFISH)13、35で完了させることが可能です。この方法では、細胞内のmRNAは、ハイブリダイゼーション、イメージング、プローブストリッピングおよび再ハイブリダイゼーションの順次ラウンドによって標識される。全体のトランスクリプトームレベルまで多重化を大幅に増加させるために、バーコード技術(例えば、MER-FISH)36、37、38が開発されている。蛍光バーコード戦略を使用して、各mRNA37,39を一意に識別します。これらの技術は組織に適応されており、かつ拡大顕微鏡と結合すると、ポリマーネットワークを有するサンプルを物理的に拡大する方法は、内因性RNA36、40、41へのプローブのアクセスを増加させることができる。MER-FISHはまた、シグナル増幅技術38によって個々の分子のシグナル輝度を増加することを可能にする。ここで説明したプロトコルは2日間のプロセスですが、標的RNAに対するプローブのハイブリダイゼーションが発生するようにsmFISHプロトコルを短くすることができるので、わずか〜5分で発生する(Turbo-FISH)26。免疫蛍光は、smFISH(IF-FISH)と組み合わせて、単一のサンプル42内のタンパク質およびmRNAを同時に検出することができる。一部の材料(すなわち、バッファーおよび固定剤)はタンパク質およびmRNA43の両方を処理するのに互換性がないため、試料中のタンパク質および/またはRNA分解の分解を低減するために各実験に利用されるFISHプローブおよび抗体に対してプロトコルを最適化する必要があります。IF-FISH プロトコル 7,18の最適化に加えて、IF-FISH 実験の成功例として、私たちの研究室のいくつかの出版物を参照してください。
結論として、刺激に対する単一細胞の不均一性および対立遺伝子の変化に関する洞察を提供する、smFISH法において単一分子蛍光を提示する。このプロトコルは、前述したモデルシステムに最適化されていますが、他の標的遺伝子モデル7を強化できる一連の可能な調整を提供します。

遺伝子の転写と翻訳は、DNA配列からRNA、タンパク質1に移り、生物学の中心的な教義に関与する2つの主要なプロセスです。本研究では、転写中のメッセンジャーRNA(mRNA)の産生に焦点を当てます。新生RNA分子には、非コードイントロンとコーディングエキソンの両方が含まれます。イントロンは、mRNAが細胞質に移動してリボソーム2,3に翻訳する前に共転写される。
従来、mRNAの測定は、RT-qPCRまたはノーザンブロッティングなどの古典的なアッセイを用いて細胞のバルク集団(数百〜数百万)で行われます。非常に強力であるが、これらの方法は、細胞間変動(表現型ヘテロジェネリティ)、転写活性対立遺伝子の数の同定、そしておそらくより重要なことに、空間情報を欠いているという洞察を提供しないことから、限定的である。最近では、単一細胞RNAシーケンシング(RNAseq)を可能にするゲノムワイド技術は、イメージング法とシーケンシング4との間のギャップを埋め始めた。しかし、RNAseqは比較的低い検出効率に苦しんでおり、処理手順は空間情報5を完全に失う結果となる。単一細胞RNAEqは、同一性細胞の集団の中で表現型ヘテロジニアリティに関する洞察を提供することができるが、その現場でのRNA蛍光(RNA-FISH)は、空間レベルでの標的遺伝子発現のより完全な探索を促進し、かつアレル単位6,7に基づく。
RNA FISHは、固定細胞内の標的RNA分子の検出と局在化を可能にする技術です。従来とは異なり、骨状の方法、現在の最先端のRNA-FISHは、標的RNA配列と相補的である市販の核酸プローブを利用し、これらのプローブはWatson-Crick塩基対合体8によってそれらの標的にハイブリダイズする。初期のシチュハイブリダイゼーション技術は、1969年にGallとPardueによって確立された同様のプロトコルを含み、サンプルとして標的RNA9に特異的にハイブリダイズした核酸プローブで処理された。もともとアッセイは放射性または色分け検出を使用して行われました。しかし、1980年代には、DNA FISHおよび後のRNA FISHへの蛍光ハイブリダイゼーション(FISH)プロトコルの開発は、より敏感な検出への経路を開き、10,11を多重化する可能性を秘めている。
RNA FISHのさらなる発展は、単一RNA分子(smFISH)12,13を検出し定量する能力をもたれている。直接検出は、プローブ自体がフルオロフォアで標識される方法です。smFISHの課題は、蛍光シグナルを明確で回折制限されたスポットとして検出するのに十分なハイブリダイジングプローブ/ターゲットが必要な点です。この問題に対処するために、1つは、標的RNA8、12、14の様々な領域に相補的な短い一本鎖DNAオリゴヌクレオチドのプローブセットを使用することができる。複数のプローブの結合は、局所的な蛍光色素密度を増加させ、蛍光顕微鏡による明確で高強度のスポットとしてRNAを可視化します。この方法は、プローブセットプール内のオリゴヌクレオチドのオフターゲット結合は、真のシグナルとスプリアスオリゴヌクレオチド結合を区別するためにスポットサイズと強度を定量的に解析することによって真のRNAスポットシグナルと区別できるため有利であり、したがって偽陽性12を低減することによってより正確な分析を促進する。
mRNAを検出する代替方法は、古典的なBACクローンベースのニック翻訳法と、最近開発された分岐DNAシステムです。BACクローンのニック翻訳法では、標識されるDNAは酵素的にニックされ、新しいヌクレオチドが露出した3'末端に追加されます。DNAポリメラーゼIの活性は、所望のプローブ15,16に至る標識ヌクレオチドを付加する。分岐DNA技術は、RNA標的と対にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを含み、これらのプローブは複数のシグナル増幅分子を利用して増幅される。この方法は、信号対雑音比を大幅に改善することができますが、蛍光スポットは大きく異なるサイズと強度17であるため、増幅は正確な定量を歪めることができます。
このプロトコルのモデルシステムとして、ガルベストンベイ/ヒューストンシップチャンネルにおける内分泌破壊化学物質の影響を定量化するためにNIEHSスーパーファンド研究プログラムの参加の一環として完全に採用され、エストロゲン受容体(ER)陽性乳癌細胞株MCF-7をERアゴニスト、17β-エストラジオール(E2)7,18,19で一晩投与した。E2は、原型的なER標的遺伝子を含む多くのER標的遺伝子を調節する、GREB17、20、21、22。ここで説明する smFISH プロトコルは、GREB1 を対象とする 2 つのスペクトル分離プローブ セットのセットを使用します。エキソンにハイブリダイズする1つとイントロンに他の1つを、成熟したRNAと新生RNA7の両方の測定を可能にする。次に、画像smFISH標識サンプルにデコンボリューションと相まって蛍光顕微鏡を使用し、画像分析ルーチンを適用して細胞当たりの活性対立胞および成熟RNAの数を定量化する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:572px;" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">17&#946; Estradiol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E2257</td>
			<td style="width:167px;">CAS Number 50-28-2</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Ambion SSC (20X) Buffer, Rnase-free</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM9770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Corning DMEM with L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MT10017CV</td>
			<td>Manufactured by Invitrogen</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8417</td>
			<td>Without sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dextran Sulfate, 50% Solution Sterile</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">3730-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline Ca++/Mg++</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21030CV</td>
			<td>Manufactured by Calbiochem</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethanol, 200 Proof (100%)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-678-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:119px;">353047</td>
			<td>Manufactured by Decon Laboratories</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS), 500 mL</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-753-2978</td>
			<td>Manufactured by Gemini Bio Products</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">GE Healthcare DeltaVision LIVE High Resolution Deconvolution Microscope</td>
			<td style="width:71px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hyclone Water, Molecular Biology Grade</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SH3053802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Immersion Oil 1.516</td>
			<td style="width:71px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">29162940</td>
			<td>Manufactured by GE Healthcare Bio-Science</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L-glutamine Solution</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MT25005Cl</td>
			<td>Manufactured by Corning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MCF-7 cells</td>
			<td style="width:71px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Molecular Grade Formamide</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">PAH5051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Olympus 60x/1.42 NA Objective</td>
			<td style="width:71px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Parafilm</td>
			<td style="width:71px;">Bemis Company, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">52858-076</td>
			<td>Distributed by VWR</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade</td>
			<td style="width:71px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicilin-Streptomycin Solution</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MT3001Cl</td>
			<td>Manufactured by Corning</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ribonucleoside Vanadyl Complex</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">101229-716</td>
			<td>Manufactured by New England Biosciences</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RNase Away</td>
			<td style="width:71px;">Ambion</td>
			<td align="right" style="width:119px;">9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium pyruvate, 100 mM</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-360-070</td>
			<td>Manufactured by Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thermo Scientific Glass Coverslips, #1.5</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-545-81P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Triton X-100, 100 mL</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP151-100</td>
			<td>Manufactured by Fisher BioReagents</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA Solution 0.25%</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T4049-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectashield Antifade Mounting Medium 10 mL</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC9265087</td>
			<td>Manufactured by Vector Laboratories</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell analysis of transcriptionally active alleles by single molecule fish

遺伝子転写は細胞生物学に不可欠なプロセスであり、細胞が内部および外部の手掛かりを解釈して応答することを可能にします。mRNA レベルを測定する従来のバルク集団法(ノーザンブロット、PCR、およびRNAseq)は、応答の細胞間変動に関する情報を提供する能力を欠いています。精密な単一細胞およびアレスリックな視覚化および定量は、単一分子RNA蛍光を使用して、その場合のハイブリダイゼーション(smFISH)で可能です。RNA-FISHは、標識されたオリゴヌクレオチドプローブを用いて標的RNAをハイブリダイズすることによって行われる。これらは中/高スループットのモダリティで画像化することができ、画像解析パイプラインを通じて、成熟したRNAと新生のRNAの両方に関する定量的なデータを単一のセルレベルで提供します。固定、パーメアビライゼーション、ハイブリダイゼーション、イメージングのステップは、ここに記載されているモデルシステムを使用して長年にわたって実験室で最適化されており、smFISH標識の単一細胞分析が成功し、堅牢になります。サンプルの準備と処理の主な目的は、信号対雑音比が高く、誤検出を低減し、より正確なデータを提供する高品質の画像を生成することです。ここでは、サンプルの準備からデータ分析までのパイプラインを、特定のサンプルに合わせて調整するための提案と最適化手順と組み合わせて説明するプロトコルを紹介します。

smFISHを介したホルモン応答を分析するために、例として、NIEHSスーパーファンド研究プログラム7への参加の文脈で環境災害における内分泌破壊化学物質の存在を決定するために、高スループットアッセイに使用されるエストロゲン受容体(ER)モデルを選びました。本実験では、付着性MCF-7乳癌細胞を、ERアゴニスト17β-エストラジオール(E2,10nM)または車両(DMSO)で24時間治療した。GREB1イントロニック(Atto 647N、 図1の赤)とエキソン(図 1のクエーサー570、緑色)配列に対するスペクトル分離プローブセットは、新生および成熟したmRNAの同時可視化と定量を可能にする。重要なのは、エストロゲン応答時間コース7の一部であることが示されている各細胞における転写活性対立遺伝子の数をマーキングする。
完成したプロトコルは、対象領域ごとに 16 ビット最大強度投影 (TIFF) を生成します。核セグメンテーションはDAPI染色核を用いて行い、核マスクを拡大することで細胞境界を推定する。GREB1イントロンとエキソン信号は、各セルにセグメント化され、割り当てられます。 図 1 は、DMSO および E2 で処理されたサンプルのデコンボルブ最大投影画像とそのセグメンテーションを示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61680/61680fig1.jpg"> 図1:smFISHサンプル画像と画像セグメンテーションの出力(A)MCF-7細胞を、DMSO(左パネル)および17βエストラジオール(E2、右パネル)で24時間処理し、GREB1イントロン(Atto 647N、新生mRNA、赤)、およびGREB1エキソン(クエーサー570、成熟mRNA、緑色)を標的とするようにハイブリダイズした。画像は60x / 1.42NAで取得され、デコンボルブされ、最大強度が投影されます。(B)からの画像(A)は、核マスクを定義する記述された画像解析パイプラインを介して処理され、細胞マスクを推定し、個々の成熟したmRNAおよび転写活性対立遺伝子を特定する。GREB1イントロンとエキソンスポットは、個々の細胞に割り当てられます。スケールバー:10 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61680/61680fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
画像解析パイプラインに続いて、1回の処理で10個のランダムフィールドをイメージングして画像境界に触れていない細胞の数を取得し、150個のDMSO処理細胞と149個のE2処理細胞があると判断した。この非数分解MCF-7細胞は、GREB1遺伝子の4つのコピーを有し、そしてイントロンおよびエキソンプローブと共に、重複するシグナルが、活性転写24に従事している対立遺伝子および細胞の数を決定する。オーバーラップイントロンとエキソンスポットを数えることによって、ゼロから4の活性GREB1対立体を持つ各治療の細胞集団の割合を決定した。前回の研究と同様に、2つ以上の活性GREB1対立を示す細胞として転写活性細胞を定義する。図2A-2Bに見られるように、E2処理細胞は、車両処理細胞7と比較して2つ以上の活性GREB1対立を示す細胞の割合が4倍に増加した。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61680/61680fig2.jpg"> 図2:細胞ごとのE2誘導GREB1の定量とアリールごとのアレーレレベル(A) 車両(青いバー)とE2(赤い棒)を比較する細胞あたりのアクティブなGREB1対立の数の分布を処理した細胞。(B) 転写活性と見なされる細胞の画分は、ここで2つ以上の活性GREB1対立遺伝子を有する細胞として定義される。(C)各治療のための細胞当たりのGREB1成熟mRNAの数の分布。(D) 母集団の平均値として表されるGREB1成熟RNA/細胞の平均数。誤差範囲は標準偏差を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61680/61680fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
イントロンは、エキソン配列のみから成る成熟したmRNAを生成するために、新生mRNAからスプライスされます。したがって、緑色スポットの数を定量することにより、細胞当たりの成熟mRNAの数をカウントすることもできる。 図2C-2Dは、E2 処理後の細胞集団における成熟したGREB1 mRNA/細胞および凝集フォールド変化(20倍)の分布の推移を示す。
E2処理の24時間にわたる元の観察に従って、すべての細胞が同じように反応するわけではない(すなわち、MCF-7集団における応答は不均質である)7。例えば、細胞当たりの成熟したGREB1 mRNAの数は、24時間E2処理された細胞においても、幅広い範囲の発現(約15倍)を示しています。バルクRNA定量法は、統計的平均化によって細胞内の転写の広範なレベルを識別することができません。これは、異種細胞間および同種細胞の集団における対立遺伝子による対立遺伝子応答を探索するsmFISHの力を強調する。

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Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

この場合の単一分子RNA蛍光蛍光(smFISH)は、単一細胞レベルで特異的なRNAのレベルおよび局在を正確に定量する方法です。ここでは、特定のRNAの単一細胞定量化のためのウェットベンチ処理、イメージングおよび画像解析のための検証済みのラボプロトコルを報告します。

単一分子FISHによる転写活性アレスの単一細胞解析

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

single-cell-analysis-transcriptionally-active-alleles-single-molecule

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

3.1K ビュー.  GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics. この場合の単一分子RNA蛍光蛍光(smFISH)は、単一細胞レベルで特異的なRNAのレベルおよび局在を正確に定量する方法です。ここでは、特定のRNAの単一細胞定量化のためのウェットベンチ処理、イメージングおよび画像解析のための検証済みのラボプロトコルを報告します。

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Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA processing, and telomere elongation. During these processes, various proteins bind and resolve G4 structures to perform their function. As the function of G4 often depends on the stability of its folded structure, it is important to investigate how G4 binding proteins regulate the stability of G4. This work presents a method to manipulate single G4 molecules using magnetic tweezers, which enables studies of the regulation of G4 binding proteins on a single G4 molecule in real time. In general, this method is suitable for a wide scope of applications in studies for proteins/ligands interactions and regulations on various DNA or RNA secondary structures.

A single-molecule magnetic tweezers platform to manipulate G-quadruplexes is reported, which allows for the study of G4 stability and regulation by various proteins.

磁気ピンセットで G quadruplexes の単一分子マニピュレーション

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

生化学

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and functions. It gave us the opportunity to explore a multiplicity of biophysical mechanisms, e.g., how bacterial adhesins bind to host surface receptors in more detail. Among other factors, the success of SMFS experiments depends on the functional and native immobilization of the biomolecules of interest on solid surfaces and AFM tips. Here, we describe a straightforward protocol for the covalent coupling of proteins to silicon surfaces using silane-PEG-carboxyls and the well-established N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemistry in order to explore the interaction of pilus-1 adhesin RrgA from the Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) with the extracellular matrix protein fibronectin (Fn). Our results show that the surface functionalization leads to a homogenous distribution of Fn on the glass surface and to an appropriate concentration of RrgA on the AFM cantilever tip, apparent by the target value of up to 20% of interaction events during SMFS measurements and revealed that RrgA binds to Fn with a mean force of 52 pN. The protocol can be adjusted to couple via site specific free thiol groups. This results in a predefined protein or molecule orientation and is suitable for other biophysical applications besides the SMFS.

This protocol describes the covalent immobilization of proteins with a heterobifunctional silane coupling agent to silicon-oxide surfaces designed for the atomic force microscopy based single molecule force spectroscopy which is exemplified by the interaction of RrgA (pilus-1 tip adhesin of S. pneumoniae) with fibronectin.

力の単一分子分光法のための蛋白質の共有結合固定

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a fluorescent dye and are spotted by a photodetector following their separation. Single molecule fluorescence imaging can provide ultrasensitive protein detection with its ability for visualizing individual fluorescent molecules. However, the application of this powerful imaging method to electrophoresis assays is hampered by the lack of ways to characterize the homogeneity of fluorescent labeling of each protein species across the proteome. Here, we developed a method to evaluate the labeling homogeneity across the proteome based on a single molecule fluorescence imaging assay. In our measurement using a HeLa cell sample, the proportion of proteins labeled with at least one dye, which we termed &#8216;labeling occupancy&#8217; (LO), was determined to range from 50% to 90%, supporting the high potential of the application of single molecule imaging to sensitive and precise proteome analysis.

Here, we present a protocol to assess the labeling homogeneity for each protein species in a complex protein sample at the single molecule level.

プロテオーム的分類の単一分子レベルでの均一性の定量化

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve intracellular structures and the dynamics of biomolecules with ~20 nm precision. A prerequisite for SMLM are fluorophores that transition from a dark to a fluorescent state in order to avoid spatio-temporal overlap of their point spread functions in each of the thousands of data acquisition frames. BODIPYs are well-established dyes with numerous conjugates used in conventional microscopy. The transient formation of red-shifted BODIPY ground-state dimers (DII) results in bright single molecule emission enabling single molecule localization microscopy (SMLM). Here we present a simple but versatile protocol for SMLM with conventional BODIPY conjugates in living yeast and mammalian cells. This procedure can be used to acquire super-resolution images and to track single BODIPY-DII states to extract spatio-temporal information of BODIPY conjugates. We apply this procedure to resolve lipid droplets (LDs), fatty acids, and lysosomes in living yeast and mammalian cells at the nanoscopic length scale. Furthermore, we demonstrate the multi-color imaging capability with BODIPY dyes when used in conjunction with other fluorescent&#160;probes. Our representative results show the differential spatial distribution and mobility of BODIPY-fatty acids and neutral lipids in yeast under fed and fasted conditions. This optimized protocol for SMLM can be used with hundreds of commercially available BODIPY conjugates and is a useful resource to study biological processes at the nanoscale far beyond the applications of this work.&#160;

Conventional BODIPY conjugates can be used for live-cell single-molecule localization microscopy (SMLM) through exploitation of their transiently forming, red-shifted ground state dimers. We present an optimized SMLM protocol to track and resolve subcellular neutral lipids and fatty acids in living mammalian and yeast cells at the nanoscopic length scale.

ライブセル超解像顕微鏡と単一分子トラッキングのための従来のBODIPYコンジュゲート

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed extensive studies of cap-dependent translation and its regulation, high resolution kinetic characterization of this translation pathway is still lacking. Recently, we developed an in vitro assay to measure cap-dependent translation kinetics with single-molecule resolution. The assay is based on fluorescently labeled antibody binding to nascent epitope-tagged polypeptide. By imaging the binding and dissociation of antibodies to and from nascent peptide&#8211;ribosome&#8211;mRNA complexes, the translation progression on individual mRNAs can be tracked. Here, we present a protocol for establishing this assay, including mRNA and PEGylated slide preparations, real-time imaging of translation, and analysis of single molecule trajectories. This assay enables tracking of individual cap-dependent translation events and resolves key translation kinetics, such as initiation and elongation rates. The assay can be widely applied to distinct translation systems and should broadly benefit in vitro studies of cap-dependent translation kinetics and translational control mechanisms.

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Tracking individual translation events allows for high-resolution kinetic studies of cap-dependent translation mechanisms. Here we demonstrate an in vitro single-molecule assay based on imaging interactions between fluorescently labeled antibodies and epitope-tagged nascent peptides. This method enables single-molecule characterization of initiation and peptide elongation kinetics during active in vitro cap-dependent translation.

キャップ依存翻訳キネティクス解析のための インビトロ 単分子イメージングアッセイ

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for hundreds of individual restriction endonuclease (REase) molecules in one experiment. This assay does not require protein labeling and can be carried out with a single imaging channel. In addition, the results of multiple individual experiments can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions. Analysis of the resulting dwell-time distributions can help elucidate the DNA cleavage mechanism by revealing the presence of kinetic steps that cannot be directly observed. Example data collected using this assay with the well-studied REase, EcoRV - a dimeric Type IIP restriction endonuclease that cleaves the palindromic sequence GAT&#8595;ATC (where &#8595; is the cut site) - are in agreement with prior studies. These results suggest that there are at least three steps in the pathway to DNA cleavage that is initiated by introducing magnesium after EcoRV binds DNA in its absence, with an average rate of 0.17 s-1 for each step.

Using quantum-dot-labeled DNA and total internal reflection fluorescence microscopy, we can investigate the reaction mechanism of restriction endonucleases while using unlabeled protein. This single-molecule technique allows for massively multiplexed observation of individual protein-DNA interactions, and data can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions.

制限エンドヌクレアーゼ媒介性DNA切断の1分子滞留時間解析

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately 20 nm to accommodate large tRNA substrates at the A-, P- and E-sites. Consequently, the ribosome dynamics are naturally de-phased quickly. Single molecule method can detect each ribosome separately and distinguish inhomogeneous populations, which is essential to reveal the complicated mechanisms of multi-component systems. We report the details of a smFRET method based on the Nikon Ti2 inverted microscope to probe the ribosome dynamics between the ribosomal protein L27 and tRNAs. The L27 is labeled at its unique Cys 53 position and reconstituted into a ribosome that is engineered to lack L27. The tRNA is labeled at its elbow region. As the tRNA moves to different locations inside the ribosome during the elongation cycle, such as pre- and post- translocation, the FRET efficiencies and dynamics exhibit differences, which have suggested multiple subpopulations. These subpopulations are not detectable by ensemble methods. The TIRF-based smFRET microscope is built on a manual or motorized inverted microscope, with home-built laser illumination. The ribosome samples are purified by ultracentrifugation, loaded into a home-built multi-channel sample cell and then illuminated via an evanescent laser field. The reflection laser spot can be used to achieve feedback control of perfect focus. The fluorescence signals are separated by a motorized filter-turret and collected by two digital CMOS cameras. The intensities are retrieved via the NIS-Elements software.

Single molecule fluorescence energy transfer is a method that tracks the tRNA dynamics during ribosomal protein synthesis. By tracking individual ribosomes, inhomogeneous populations are identified, which shed light on mechanisms. This method can be used to track biological conformational changes in general to reveal dynamic-function relationships in many other complexed biosystems. Single molecule methods can observe non-rate limiting steps and low-populated key intermediates, which are not accessible by conventional ensemble methods due to the average effect.

リボソームタンパク質合成の単一分子蛍光エネルギー転移研究

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 (FET) family of fusion oncoproteins, is one of the most frequently involved fusion genes in Ewing sarcoma. These FET family fusion proteins typically harbor a low-complexity domain (LCD) of FET protein at their N-terminus and a DNA-binding domain (DBD) at their C-terminus. EWS-FLI1 has been confirmed to form biomolecular condensates at its target binding loci due to LCD-LCD and LCD-DBD interactions, and these condensates can recruit RNA polymerase II to enhance gene transcription. However, how these condensates are assembled at their binding sites remains unclear. Recently, a single-molecule biophysics method-DNA Curtains-was applied to visualize these assembling processes of EWS-FLI1 condensates. Here, the detailed experimental protocol and data analysis approaches are discussed for the application of DNA Curtains in studying the biomolecular condensates assembling on target DNA.

Here, we describe the use of the single-molecule imaging method, DNA Curtains, to study the biophysical mechanism of EWS-FLI1 condensates assembling on DNA.

DNA上に集合したEWS-FLI1凝縮体の1分子イメージング

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved single-molecule studies and has gained immense popularity in detecting and understanding the dynamic behavior of fluorescent-tagged molecules. Here, we describe a detailed method for&#160;in vitro single-molecule studies of kinesin-3 family motors using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy. Kinesin-3 is a large family that plays critical roles in cellular and physiological functions ranging from intracellular cargo transport to cell division to development. We have shown previously that constitutively active dimeric kinesin-3 motors exhibit fast and superprocessive motility with high microtubule affinity at the single-molecule level using cell lysates prepared by expressing motor in mammalian cells. Our lab studies kinesin-3 motors and their regulatory mechanisms using cellular, biochemical and biophysical approaches, and such studies demand purified proteins at a large scale. Expression and purification of these motors using mammalian cells would be expensive and time-consuming, whereas expression in a prokaryotic expression system resulted in significantly aggregated and&#160;inactive protein. To overcome the limitations posed by bacterial purification systems and mammalian cell lysate, we have established a robust Sf9-baculovirus expression system to express and purify these motors. The kinesin-3 motors are C-terminally tagged with 3-tandem fluorescent proteins (3xmCitirine or 3xmCit) that provide enhanced signals and decreased photobleaching. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of Sf9 purified proteins demonstrate that kinesin-3 motors are fast and superprocessive akin to our previous studies using mammalian cell lysates. Other applications using these assays include detailed knowledge of oligomer conditions of motors, specific binding partners paralleling biochemical studies, and their kinetic state.

This study details purification of KIF1A(1-393LZ), a member of kinesin-3 family, using Sf9-baculovirus expression system. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of these purified motors exhibited robust motility properties comparable to motors from mammalian cell lysate. Thus, Sf9-baculovirus system is amenable to express and purify motor protein of interest.

Sf9精製超加工キネシン-3ファミリーモーターの1分子解析

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction with lipids employ naked bilayer membranes. Such systems lack the complexities of crowding by membrane-embedded proteins and glycans and exclude the associated volume effects encountered on cellular membrane surfaces. Also, the negatively charged glass surface onto which the lipid bilayers are formed prevents the free diffusion of transmembrane biomolecules. Here, we present a well-characterized polymer-lipid membrane as a mimic for crowded lipid membranes. This protocol utilizes polyethylene glycol (PEG)-conjugated lipids as a generalized approach for incorporating crowders into the supported lipid bilayer&#160;(SLB). First, a cleaning procedure of the microscopic slides and coverslips for performing single-molecule experiments is presented. Next, methods for characterizing the PEG-SLBs and performing single-molecule experiments of the binding, diffusion, and assembly of biomolecules using single-molecule tracking and photobleaching are discussed. Finally, this protocol demonstrates how to monitor the nanopore assembly of bacterial pore-forming toxin Cytolysin A (ClyA) on crowded lipid membranes with single-molecule photobleaching analysis. MATLAB codes with example datasets are also included to perform some of the common analyses such as particle tracking, extracting diffusive behavior, and subunit counting.

Here, a protocol to perform and analyze the binding, mobility, and assembly of single molecules on artificial crowded lipid membranes using single-molecule total internal reflection fluorescence (smTIRF) microscopy is presented.

高分子密集脂質膜上での1分子拡散と集合

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction ...