MAM, FS ve MGM NIEHS (Proje 4, P42ES027704, PI, Rusyn) tarafından finanse edilmektedir. MAM, FS, RMM, MGM ve PKS, CPRIT tarafından finanse edilen GCC İleri Mikroskopi ve Görüntü Bilişim Merkezi (RP170719) tarafından desteklenmektedir. Görüntüleme ayrıca Baylor College of Medicine'daki Entegre Mikroskopi Çekirdeği tarafından NIH (DK56338 ve CA125123), CPRIT (RP150578), Dan L. Duncan Kapsamlı Kanser Merkezi ve John S. Dunn Gulf Coast Kimyasal Genomik Konsorsiyumu tarafından desteklenmektedir.

En iyi sonuçları elde etmek için, bu protokolün ıslak laboratuvar kısmı tüm adımlarda standart RNase içermeyen önlemler gerektirir. Örneğin, filtrelenmiş pipet uçları, steril kaplar ve RNase içermeyen tamponların kullanımı oldukça teşvik edilir. Özellikle düşük bolluk hedef RNA'ları için vanadyl ribononcleoside kompleksleri gibi RNaz inhibitörlerinin kullanılması da önerilir.
1. Hücre kültürü ve deneysel kurulum
<ol><li>Bir T75 doku kültürü şişesinde yapışık MCF-7 meme kanseri hücrelerini (ATCC #HTB-22) fenol-kırmızı içermeyen (sadece hormon stimülasyon deneyleri için gereklidir) Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium (DMEM) ile desteklenmiş % 10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L-glutamin, 1 nM sodyum piruvat, 50 I.U./mL penisilin ve 50 μg/mL streptomisin.</li>
	<li>Asitle kazınmış, poli-D-lizin kaplı yuvarlak kapakları (0,16 ila 0,19 mm kalınlığında, 12 mm çapında) 24 çokwell doku kültürü plakasına yerleştirin. NOT: Standart protokollere göre steril PBS'de (Ca++ ve Mg ++ içermeyen fosfat tamponlu salin)yeniden inşa edilmiş 1 mg/mL poli-D-lizin çözeltisi ile kapakları ve kaplamayı asitle kazımak için 1 M HCl kullanın.</li>
	<li>Büyüme ortamını hücrelerden çıkarın ve 5 mL steril PBS (Ca++ ve Mg++içermeyen fosfat tamponlu salin) ile bir kez yıkayın. MCF-7 hücrelerini 2-3 mL Trypsin-EDTA%0.25 çözeltisi kullanarak ayırın. Hücreler ayrıldıktan sonra, Trypsin-EDTA% 0.25 çözeltisini eşit hacimli büyüme ortamıyla nötralize edin.</li>
	<li>Ortam süspansiyonundaki hücreleri 15 mL konik bir tüpe aktarın, hücreleri saçmak için 1 dakika boyunca 391 x g'da aşağı çevirin. Hücre peletini bozmadan ortamı konik tüpten dikkatlice çıkarın ve hücreleri uygun miktarda tedavi ortamına yeniden biriktirin. NOT: Tedavi ortamı% 5 kömür-dektran soyulmuş ve dialyzed FBS, 2 mM L-glutamin, 1 nM sodyum piruvat, 50 I.U./mL penisilin ve 50 μg/mL streptomisin ile desteklenmiş fenol-kırmızısız DMEM'dir. Bu medya steroid hormon stimülasyon deneyleri için gereklidir, çünkü serum bileşeni büyük ölçüde medyayı sıyırarak steroidlerin tükendi ve diyaliz yoluyla büyüme faktörlerini azalttı.</li>
	<li>Hücreleri, 500 μL tedavi medyasında kuyu başına 60.000 ila 70.000 hücrede 24 multiwell plakadaki kapaklara tohumlayın. Bu deney için tedavi başlatmada hücre konflüensi %70-80 civarında olmalıdır. Görüntü analizini zorlaştıran izdiahtan kaçınmak için hücre tipine, büyüme hızına ve denemenin uzunluğuna bağlı olarak hücre tohumlama yoğunluğunu optimize edin. NOT: En iyi görüntüleme ve görüntü analizi için hücre topaklamadan kaçının. Bu amaçla, kuyulara dağıtmadan önce hücreleri birkaç kez pipetleme (veya kısaca girdap) ile hücrelerin aliquot'unu iyice karıştırın. Kaplamalı hücreleri inkübatöre geri yerleştirmeden önce, hücrelerin doku kültürü başlığına yaklaşık 20 dakika yerleşmesine izin vermek hücre topaklamayı azaltmaya yardımcı olur.</li>
	<li>Büyüme ortamlarının sıyrılmış/çaprazlanmış serumunda kalan sinyal molekülleri nedeniyle hücre döngüsü senkronizasyonunu ve arka plan küçültmesini sağlamak için tedavilerden önce hücreleri en az iki gün kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Tedavi ortamlarında 48 saatlik bir inkübasyondan sonra, MCF-7 hücrelerini 24 saat boyunca tedavi medyasında seyreltilmiş 10 nM 17β-estradiol (E2) ve araç kontrolü (DMSO) ile tedavi edin. Bu tedavi, maksimum tepki vermek için doygun bir E2 dozu kullanır. Farklı hedef genler, hücre modelleri ve tedavi türü için koşulları ampirik olarak belirlemek için zaman seyri ve doz-yanıt deneyleri yapın. Örnek olarak, son yayınımıza bakın7.</li>
</ol>2. Tamponların hazırlanması
<ol><li>Fiksasyon tamponunu hazırlamak için, saflaştırılmış, monomerik formaldehit (elektron-mikroskopi tedarikçileri tarafından% 16 paraformaldehit olarak satılır) steril PBS Ca++/ Mg++ (fosfat tamponlu salin artı Ca++ ve Mg++) içinde% 4'e seyreltin. RNA bozulmasını geciktirmek için 2 mM'lik son konsantrasyon için fiksasyon tamponuna vanadyl ribonucleoside kompleksleri (VRC) ekleyin.<ol>
<li>24 multiwell plakanın kuyusu başına 300-500 μL sabitleyici gerektirerek toplam sabitleme tamponu miktarını hesaplayın. %4 formaldehiti sabitleme adımında gerekli olana kadar buzda saklayın. NOT: Sabitleme arabelleği her deneme için taze hale getirin. DİkKAT: Formaldehit, deriden emilen bir teraojendir. Bu kimyasalı, kurumsal düzenlemelerinize göre uygun KKD ile birlikte duman kaputunda kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Permeabilizasyon adımı için çekirdeksiz suda% 70 etanol hazırlayın. Alternatif bir seçenek steril PBS Ca++ /Mg ++artı 2 mM VRC'de %0,5 Triton-X100'dür. Kuyu başına 500 μL tampon kullanarak gereken toplam permeabilizasyon tampon miktarını hesaplayın.</li>
	<li>Hibridizasyon tamponunun 9 mL'sini hazırlamak için, 6 mL çekirdeksiz suya 2 mL stok% 50 dektran sülfat ve 1 mL 20x SSC (salin sodyum sitrat) tamponu ekleyin. Hibridizasyon tamponunu iyice karıştırmak için girdap. Bu tampon 4 °C'de bir haftaya kadar saklanabilir.</li>
	<li>2x salin sodyum sitrat (SSC) tampon gerektiren beş ayrı yıkama adımı vardır. Yıkama adımı başına kapak parçası başına 500 μL tampon öngörerek gereken 2x SSC tamponun son hacmini hesaplayın. Gerekli stok miktarını çekirdeksiz suda 20x SSC tamponu seyreltin. Ekstra bir önlem olarak yıkama adımlarına 2 mM VRC eklenebilir. Bu tampon, işlem adımları süresince oda sıcaklığında saklanabilir.</li>
</ol>3. RNA FISH için fiksasyon
<ol><li>Tedaviden sonra, medyayı kuyulardan çıkarın ve steril, soğuk PBS Ca++/ Mg++ile bir kez yıkayın. Düşük yapışma hücresi modeli kullanılıyorsa, sıvıyı aspire etmek için vakum kullanmayın; ortamı kuyunun kenarından dikkatlice çıkarmak ve ilk yıkama adımını atlamak için manuel pipetleme kullanın. Buz üzerinde 30 dakika boyunca 500 μL sabitleme tamponu ekleyin. NOT: Numune RNA bozulmasına eğilimliyse, bu noktada yıkama adımı için 2 mM VRC'li steril PBS kullanın.</li>
	<li>Kurumsal düzenlemelere göre fiksatifi kaldırın ve kimyasal atıklara atın. Hücreleri soğuk steril PBS Ca++/Mg++ ile iki kez 3 dakika yıkayın.</li>
	<li>PBS'yi çıkarın ve her kuyuya 500 μL% 70 etanol ekleyin. 24 kuyu plakasını bir parafin plastik filmle kapatın. En az dört saat boyunca 4 °C'de bir rotator üzerine yerleştirin. Örnekleri bir gecede% 70 etanolde bırakmak en iyisidir. Protokol bu noktada duraklatılabilir ve numuneler% 70 etanolde bir haftaya kadar saklanabilir. NOT: Alternatif olarak 2 mM VRC solüsyonlu PBS'de %0,5 Triton-X100 kullanılabilir. Numuneleri bu permeabilizasyon tamponunun 500 μL'sinde bir rotatörde oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın. Bu permeabilizasyon arabelleği kullanılırsa, iletişim kuralı bu noktada duraklatılamaz ve karma oluşturma adımı boyunca devam etmelidir.</li>
</ol>4. RNA FISH için hibridizasyon
<ol><li>Permeabilizasyon tamponunu çıkarın ve bir rotatörde oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 μL 2x SSC tampon artı% 10 formamid olarak bir kez yıkayın.</li>
	<li>Tüm karma arabelleği hazırlayın. Kapak sapası başına yaklaşık 30 μL tam hibridizasyon tamponu hesaplayın. Gereken yüzdeye ulaşmak için karma arabelleğe formamid ekleyin. Örneğin, 500 μL tam hibridizasyon tamponu gerekiyorsa, daha önce yapılan hibridizasyon tamponunun 450 μL'sine ek olarak% 10 vol/ vol'a ulaşmak için 50 μL moleküler sınıf formamidden oluşacaktır. Vortex kısaca karıştırmak için. DİkKAT: Formamid, deriden emilen bir teraratojendir. Bu kimyasalı, kurumsal düzenlemelere göre uygun KKD ile birlikte duman kaputunda kullanın.</li>
	<li>Greb1 intronunu (Atto 647N ile etiketlenmiştir) ve GREB1 eksonunu (Quasar 570 ile etiketlenmiştir) probları 1:300 hibridizasyon tamponunda seyreltin. Pipetleme ile karıştırın. Bu arabelleği ışığa karşı koruyun ve hemen kullanın. NOT: Problar Stossi ve ark7'deayrıntılı olarak belirtildiği gibi tasarlanmış ve üretilmiştir. Problar genellikle üretici protokolü14'egöre RNA içermeyen TE arabelleği içinde yeniden uzlaştırılması gereken kurutulmuş bir oligonükleotid prob havuzu olarak sağlanır. Bu problar için stok çözeltisi 12,5 μM idi, bu nedenle; probların çalışma konsantrasyonu 42 nM'dir.</li>
	<li>Gece hibridizasyon adımı için nemlendirici bir oda hazırlayın. RNases kaldırmak için bir yüzey dekontaminant ile temizlenmiş bir cam Petri kabı içine, pozlanmamış tarafı yukarı bir parafin plastik film parçası yerleştirin. İki kağıt havluyu steril suyla doyutun ve kurutma belirli etiketlemeyi yok edebileceğinden, nem sağlamak için Petri kabının kenarlarına yerleştirin.</li>
	<li>Parafin plastik filminin temiz tarafına hibridizasyon tamponunda 30 μL prob noktalama ile probları aliquot. Kapakların birbirleriyle temas etmemeleri için probların aliquotlarını dağıtın.</li>
	<li>Sterilize edilmiş tokseps kullanarak, kapak hücre tarafını cam Petri kabındaki problara hafifçe aşağı çevirin. Hava kabarcıklarından kaçının ve kapaklara basınç uygulamayın. NOT: Sonraki adımlar için gerekli olacağından, doku kültürü plakasını 2x SSC tamponu ile atmayın.</li>
	<li>Cam Petri kabını parafin plastik filmle kapatın ve floroforlara ışığın maruz kalmasını önlemek için plakayı folyo ile örtün. Düz dönmeyen bir yüzeyde 37 °C'de 16 saate kadar gece boyunca kuluçkaya yatırın. Kuluçka süresi ampirik olarak değiştirilebilir, ancak en az 4 saat önerilir. NOT: Kapaklar, hibridizasyon tamponunda kuluçka yaparken kaymaya karşı hassastır, bu da kapakta kuru noktalara yol açabilir ve numuneye zarar verebilir.</li>
</ol>5. Görüntüleme için numunelerin hazırlanması 
<ol><li>Ertesi gün, kapakları nemlendirici hazneden tokmaklar kullanarak çıkarın ve hücre tarafı yukarı olacak şekilde 24 kuyu plakasına geri döndürün. Fazla probu ve spesifik olmayan hibridizasyonu yıkamak için 500 μL taze 2x SSC tampon artı% 10 formamid ekleyin. NOT: Numuneleri bu noktadan itibaren ışıktan koruyun.</li>
	<li>Isıtılmış bir rotatörde her biri 37°C'de 15 dakika boyunca 500 μL 2x SSC tampon artı %10 formamid ile hücreleri iki kez yıkayın.</li>
	<li>DNA'yı 2x SSC tamponda 1 μg/mL'de DAPI ile bir rotatörde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca karşı verin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2x SSC tampon ile bir kez yıkayın.</li>
	<li>Kapakları, fazla tuzları ortadan kaldırmak için kağıt havlu ve nükleaz içermeyen suda hızlı bir yıkama ile fazla 2x SSC tamponu çıkardıktan sonra sertleşmeyen montaj ortamı kullanarak cam slaytlara monte edin. Son olarak, kapakları açık oje ile kapatın.</li>
</ol>6. Yüksek çözünürlüklü mikroskopi ve görüntü işleme
<ol><li>Örnekleri 60x veya 100x yağ hedefi ve bir sCMOS kamera kullanarak geniş alan epifluoresans mikroskobuna görüntüleyin. Bu deney için kullanılan belirli mikroskop ve amaç için malzeme tablosuna bakın.<ol>
<li>Sinyalin zamana bağlı bozulmasını önlemek için numuneler tam olarak işlenir işlenmez görüntülemeyi tamamlayın. NOT: Bu deneyde kırılma indisi (RI) 1.516 olan daldırma yağı kullanılmaktadır. RI uyuşmazlıkları görüntü bozulmasını etkileyecek nokta yayılma işlevinin sapmalarına neden olacağından, yağ RI'sını belirli örneklerle eşleştirmek için ampirik test yapılmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Görüntüler 0,10827 μm yanal piksel boyutuyla yakalanır.</li>
	<li>En yüksek yoğunluğa (yani pozitif kontrollere) sahip olması beklenen örneği kullanarak ışık kaynağından aydınlatma miktarını (yani, yüzde geçirgenlik) ve her kanal için pozlama sürelerini (bu özel örnekteki DAPI, TRITC, CY5 filtreleri) optimize edin. Bu deneyde, E2 ile işlenmiş numunenin her iki GREB1 prob seti için daha yüksek yoğunluğa sahip olması beklenmiştir. Genellikle GREB1 intron ve exon probları için yüzde geçirgenlik %50 – 100'dür ve maruz kalma süreleri 0,25 – 0,60 saniye arasında değişmektedir.</li>
	<li>Ayrıca, fotobleaching ve/veya kamera piksellerinin doygunluğunu önleyen koşullar altında görüntüler alıp alın. Deneyimlerimize göre, arka plan ve sinyal yoğunluğu arasında en az ~ on kat fark olmalıdır. Birkaç piksel/alanın doygunluğu, numunedeki spesifik olmayan sinyaller (örneğin, kapaktaki kir, hücre dışındaki prob agregaları) nedeniyle oluşabilir, ancak yalnızca doymuş bölgeler niceme dahil değilse.</li>
	<li>z yığınının alımını ayarlamak için DAPI kanalındaki örneğe odaklanın. DAPI lekeli çekirdeklerin odak dışı kaldığı mesafelerde z yığınının üst ve alt kısmını seçin. Kullandığımız z-yığını adım boyutu dilim başına 0,25 μm'dir ve toplam z-yığını tüm hücreyi kapsamalıdır (MCF-7 hücrelerinde yaklaşık 10 μm). Ancak, z-yığını adım boyutu kullanılan hedefe göre değişecektir ve Nyquist örnekleme kriterini izlemelidir. NOT: intronlar genellikle sadece çekirdekte bulunur; ancak, eksonlar hem çekirdekte hem de sitoplazmdadır. Bu nedenle, z yığınını yukarıda açıklandığı gibi ayarlamak, z yığını tüm hücreyi kapsadığı için intron ve exon etiketlemesinin çoğunu yakalar.</li>
	<li>Tipik olarak, hücreler arasındaki yanıt ve varyasyonun büyüklüğünün anlık görüntüsünü yakalamak için ön deneylerde nicel analiz için en az 200 hücre görüntüleyin.</li>
	<li>Bazı görüntülenmiş hücreler, analiz ardışık düzeni (örneğin, görüntünün kenarlıklarına dokunan hücreler, apoptotik/mitotik hücreler) tarafından filtrelenecekleri için son analizden (yani bırakma oranından) hariç tutulur. NOT: Görüntü alanlarını seçerken, akılda tutulması gereken birkaç faktör vardır. DAPI etiketli, nükleer floresan tarafından tanımlanan eşit yayılmış, örtüşmeyen hücrelere sahip alanları seçin. Ayrıca, kısmi hücrelerin sayılmasını önlemek için görüntü alanının kenarları boyunca en az çekirdek sayısına sahip alanları seçmeye çalışın. İstatistiksel analiz gerektiren deneyler için her zaman otomatik, tarafsız görüntüleme tercih edilir.</li>
	<li>Edinimden sonra, 10 döngü (yani yineleme sayısı) kullanarak agresif bir restoratif algoritma kullanarak görüntüleri deconvolve edin. Görüntü analizi için maksimum yoğunluklu projeksiyonlar oluşturun (belirli bir 3D analiz gerekiyorsa bu adımı atla). Kullanılan kameranın bit derinliğine göre tüm projeksiyon görüntülerini kaydedin; Bizim durumumuzda 16-bit TIFF gri tonlamalı görüntüler kaydedildi. RGB görüntüler, bilgi kaybına neden olan daha az bit derinliğine sahiptir; bu nedenle, RGB görüntüler görüntü analizi için uygun değildir.</li>
</ol>7. Görüntü analizi 
<ol><li>Talimatları okuyun ve jupyter dizüstü bilgisayarı github'dan indirin(https://github.com/pankajmath/RNA_FISH_analysis).</li>
	<li>Python anakonda dağıtımını (https://www.anaconda.com/distribution/) sürüm 3.6 veya üst sürümünü yükleyin.</li>
	<li>Anaconda istemini açın ve anakonda için Basit ITK Yüklemek için yükleme komutunu yazın(https://anaconda.org/SimpleITK/simpleitk).</li>
	<li>Anaconda navigator'ı açın ve jupyter dizüstü bilgisayarı başlatın. Dizinleri ve dosyaları gösteren bir web tarayıcısı açacaktır. Github'dan indirilen jupyter not defterini içeren dizine ulaşmak için dizin yapılarına göz atın.</li>
	<li>Not defterini açın ve Shift ve Enter tuşlarına aynı anda basarak her hücreyi çalıştırın.</li>
	<li>Not defterinde sağlanan her işlevin ve adımın ayrıntılarını izleyin. Farklı bir görüntü kümesi için bazı parametre değerlerinin değiştirilmesi gerekebilir. NOT: Kısacası, çekirdekler 251 piksel blok boyutuyla yerel eşik kullanılarak DAPI kanalından bölünür, delikler doldurulur ve 100 pikselden küçük nesneler kaldırılır. Dokunan çekirdekler bir havza algoritması kullanılarak bölündü. Nükleer maske daha sonra 100 piksel genişletildi ve çekirdekleri havza olarak kullanarak dokunaklı nesneleri ayırmak için su havzası kullanıldı. Sabit durum RNA'sını (eksonları) tanımlamak için Otsu eşiği kullanıldı; transkripsiyonel aktif aleller (intron) için önce Gauss bulanıklığı (sigma=1) uygulandı ve daha sonra maksimum entropi eşiği kullanıldı.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Russell, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression:+Transcription.">Gene Expression: Transcription.</a> iGenetics: A Mendelian Approach. , 331-352 (2006).</li><li>Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variety+in+the+level+of+gene+control+in+eukaryotic+cells.">Variety in the level of gene control in eukaryotic cells.</a> Nature. 297, 365-371 (1982).</li><li>K&#246;hler, A., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exporting+RNA+from+the+nucleus+to+the+cytoplasm.">Exporting RNA from the nucleus to the cytoplasm.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 761-773 (2007).</li><li>Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Technology+and+Biology+of+Single-Cell+RNA+Sequencing.">The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing.</a> Molecular Cell. 58, 610-620 (2015).</li><li>Shah, S., Lubeck, E., Zhou, W., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+Transcription+Profiling+of+Single+Cells+Reveals+Spatial+Organization+of+Cells+in+the+Mouse+Hippocampus.">In situ Transcription Profiling of Single Cells Reveals Spatial Organization of Cells in the Mouse Hippocampus.</a> Neuron. 92, 342-357 (2016).</li><li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bursty+Gene+Expression+in+the+Intact+Mammalian+Liver.">Bursty Gene Expression in the Intact Mammalian Liver.</a> Molecular Cell. 58, 147-156 (2015).</li><li>Stossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen-induced+transcription+at+individual+alleles+is+independent+of+receptor+level+and+active+conformation+but+can+be+modulated+by+coactivators+activity.">Estrogen-induced transcription at individual alleles is independent of receptor level and active conformation but can be modulated by coactivators activity.</a> Nucleic Acids Research. 48, 1800-1810 (2020).</li><li>Coassin, S. R., Orjalo, A. V., Semaan, S. J., Johansson, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Detection+of+Nuclear+and+Cytoplasmic+RNA+Variants+Utilizing+Stellaris+RNA+Fluorescence+In+situ+Hybridization+in+Adherent+Cells.">Simultaneous Detection of Nuclear and Cytoplasmic RNA Variants Utilizing Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization in Adherent Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1211, 189-199 (2014).</li><li>Gall, J. G., Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+detection+of+RNA-DNA+hybrid+molecules+in+cytological+preparations.">Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations.</a> Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 63, 378-383 (1969).</li><li>Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+fluorescence+microscopical+localization+of+specific+DNA+sequences+by+in+situ+hybridization+of+fluorochrome+labelled+RNA.">A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochrome labelled RNA.</a> Experimental Cell Research. 128, 485-490 (1980).</li><li>Singer, R. H., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+gene+expression+visualized+in+chicken+muscle+tissue+culture+by+using+in+situ+hybridization+with+biotinated+nucleotide+analog.">Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with biotinated nucleotide analog.</a> Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 79, 7331-7335 (1982).</li><li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280, 585-590 (1998).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5, 877-879 (2008).</li><li>Orjalo, A. V., Johansson, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stellaris+RNA+Fluorescence+In+situ+Hybridization+for+the+Simultaneous+Detection+of+Immature+and+Mature+Long+Noncoding+RNAs+in+Adherent+Cells.">Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization for the Simultaneous Detection of Immature and Mature Long Noncoding RNAs in Adherent Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1402, 119-134 (2016).</li><li>Johnson, C. V., Singer, R. H., Lawrence, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3+Fluorescent+Detection+of+Nuclear+RNA+and+DNA:+Implications+for+Genome+Organization.">Chapter 3 Fluorescent Detection of Nuclear RNA and DNA: Implications for Genome Organization.</a> Methods in Cell Biology. 35, 73-99 (1991).</li><li>Levsky, J. M., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization:+Past,+present+and+future.">Fluorescence in situ hybridization: Past, present and future.</a> Journal of Cell Science. 116, 2833-2838 (2003).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+A+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).</li><li>Stossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+estrogenic+mechanisms+of+bisphenol+A+analogs+through+high+throughput+microscopy-based+contextual+assays.">Defining estrogenic mechanisms of bisphenol A analogs through high throughput microscopy-based contextual assays.</a> Chemistry and Biology. 21, 743-753 (2014).</li><li>Szafran, A. T., Stossi, F., Mancini, M. G., Walker, C. L., Mancini, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+properties+of+non-estrogenic+substituted+bisphenol+analogs+using+high+throughput+microscopy+and+image+analysis.">Characterizing properties of non-estrogenic substituted bisphenol analogs using high throughput microscopy and image analysis.</a> PLoS One. 12, 1-19 (2017).</li><li>Rae, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GREB1+is+a+critical+regulator+of+hormone+dependent+breast+cancer+growth.">GREB1 is a critical regulator of hormone dependent breast cancer growth.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 92, 141-149 (2005).</li><li>Heldring, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptors:+How+do+they+signal+and+what+are+their+targets.">Estrogen receptors: How do they signal and what are their targets.</a> Physiological Reviews. 87, 905-931 (2007).</li><li>Hah, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+extensive,+and+transient+transcriptional+response+to+estrogen+signaling+in+breast+cancer+cells.">A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells.</a> Cell. 145, 622-634 (2011).</li><li>Kadam, P., Bhalerao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+size+calculation.">Sample size calculation.</a> International Journal of Ayurveda Research. 1, 55-57 (2010).</li><li>Kocanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+estrogen-responsive+genes+does+not+require+their+nuclear+co-localization.">Activation of estrogen-responsive genes does not require their nuclear co-localization.</a> PLoS Genetics. 6, (2010).</li><li>Shaffer, S. M., Wu, M. T., Levesque, M. J., Raj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turbo+FISH:+A+Method+for+Rapid+Single+Molecule+RNA+FISH.">Turbo FISH: A Method for Rapid Single Molecule RNA FISH.</a> PLoS One. 8, (2013).</li><li>Kim, S. O., Kim, J., Okajima, T., Cho, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+paraformaldehyde-treated+individual+cells+investigated+by+atomic+force+microscopy+and+scanning+ion+conductance+microscopy.">Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy.</a> Nano Convergence. 4, (2017).</li><li>Shieh, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+ribonucleoside+vanadyl+complex+(RVC)+for+developing+a+multifunctional+tissue+preservative+solution.">Application of ribonucleoside vanadyl complex (RVC) for developing a multifunctional tissue preservative solution.</a> PLoS One. 13, 1-14 (2018).</li><li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy.">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).</li><li>Vinegoni, C., Feruglio, P. F., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+dynamic+range+fluorescence+imaging.">High dynamic range fluorescence imaging.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25, (2019).</li><li>Tam, R., Shopland, L. S., Johnson, C. V., McNeil, J. A., Lawrence, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+RNA+FISH+for+visualizing+gene+expression+and+nuclear+architecture.">Application of RNA FISH for visualizing gene expression and nuclear architecture.</a> FISH: A Practical Approach. , 93-117 (2002).</li><li>Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tutorial:+guidance+for+quantitative+confocal+microscopy.">Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy.</a> Nature Protocols. , (2020).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast.">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nature Protocols. 7, 408-419 (2012).</li><li>Kwon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+fluorescence+in+situ+hybridization:+Quantitative+imaging+of+single+RNA+molecules.">Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules.</a> BMB Reports. 46, 65-72 (2013).</li><li>Sibarita, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvolution+microscopy.">Deconvolution microscopy.</a> Advcances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 201-243 (2005).</li><li>Takei, Y., Shah, S., Harvey, S., Qi, L. S., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Dynamic+Imaging+of+Genomic+Loci+by+Combined+CRISPR+Imaging+and+DNA+Sequential+FISH.">Multiplexed Dynamic Imaging of Genomic Loci by Combined CRISPR Imaging and DNA Sequential FISH.</a> Biophysical Journal. 112, 1773-1776 (2017).</li><li>Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Imaging+with+Multiplexed+Error-Robust+Fluorescence+in+situ+Hybridization+(MERFISH).">RNA Imaging with Multiplexed Error-Robust Fluorescence in situ Hybridization (MERFISH).</a> Methods in Enzymology. 572, 1-49 (2016).</li><li>Shah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+Spatial+Genomics+of+the+Nascent+Transcriptome+by+Intron+seqFISH.">Dynamics and Spatial Genomics of the Nascent Transcriptome by Intron seqFISH.</a> Cell. 174, 363-376 (2018).</li><li>Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+detection+of+RNA+using+MERFISH+and+branched+DNA+amplification.">Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification.</a> Scientific Reports. 9, 1-13 (2019).</li><li>Lubeck, E., Coskun, A. F., Zhiyentayev, T., Ahmad, M., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+in+situ+RNA+profiling+by+sequential+hybridization.">Single-cell in situ RNA profiling by sequential hybridization.</a> Nature Methods. 11, 360-361 (2014).</li><li>Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+imaging+of+high-density+libraries+of+RNAs+with+MERFISH+and+expansion+microscopy.">Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8, (2018).</li><li>Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy:+principles+and+uses+in+biological+research.">Expansion microscopy: principles and uses in biological research.</a> Nature Methods. 16, 33-41 (2019).</li><li>Zimmerman, S. G., Peters, N. C., Altaras, A. E., Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+RNA+ISH,+RNA+FISH+and+protein-RNA+double+labeling+(IF/FISH)+in+Drosophila+ovaries.">Optimized RNA ISH, RNA FISH and protein-RNA double labeling (IF/FISH) in Drosophila ovaries.</a> Nature Protocols. 8, 2158-2179 (2013).</li><li>Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+mRNA+and+protein+in+single+cells+using+immunofluorescence-combined+single-molecule+RNA+FISH.">Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH.</a> Biotechniques. 59, 209-221 (2015).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Açıklanan smFISH metodolojisi daha önce yayınlanan7, 12,14protokollerine dayanmaktadır. Bu protokolde, ıslak laboratuvardan (tohumlama yoğunluğu, sabitleme süresi, permeabilizasyon ve prob konsantrasyonu dahil) görüntüleme ve görüntü analizine kadar optimize edilen kritik adımları açıklıyoruz ve gen transkripsiyonunun tek hücreli analizini yapmak isteyen laboratuvarlar için tam bir deneysel boru hattı sağ...

Gen transkripsiyon ve çeviri, DNA dizisinden RNA'ya ve protein1'ekadar biyolojinin merkezi dogmasında yer alan iki ana süreçtir. Bu çalışmada transkripsiyon sırasında haberci RNA (mRNA) üretimine odaklanıyoruz. Nascent RNA molekülü hem kodlamayan intronları hem de kodlama eksonlarını içerir. Intronlar, mRNA ribozomlar üzerinde çeviri için sitoplazma hareket etmeden önce eş-transkripsiyonel olarak birlenir2,3.
Geleneksel olarak, mRNA ölçümü, RT-qPCR veya Kuzey şişkinliği gibi klasik tahlillerle hücrelerin toplu popülasyonlarında (yüzlerce ila milyon) gerçekleştirilir. Çok güçlü olsa da, bu yöntemler hücreden hücreye varyasyon (fenotipik heterojenlik), transkripsiyonel olarak aktif alellerin sayısının tanımlanması ve belki de daha da önemlisi mekansal bilgi eksikliği hakkında içgörü sağlamadıkları için sınırlıdır. Daha yakın zamanda, tek hücreli RNA dizilimine (RNAseq) izin sağlayan genom geniş teknolojileri görüntüleme yöntemleri ile sıralama4arasındaki boşluğu kapatmaya başladı. Bununla birlikte, RNAseq nispeten düşük algılama verimliliklerinden muzdariptir ve işleme adımları uzamsal bilgilerin tamamen kaybolmasına neden5. Tek hücreli RNAseq, izojenik hücre popülasyonu arasında fenotipik heterojenlik hakkında içgörüler sağlayabilse de, RNA floresan in situ hibridizasyon (RNA-FISH) mekansal düzeyde ve aletle bazında hedef gen ekspresyonunun daha eksiksiz bir şekilde araştırılmasını kolaylaştırabilir6,7.
RNA FISH, sabit hücrelerdeki hedef RNA moleküllerinin tespitini ve lokalizasyonunu sağlayan bir tekniktir. Daha önceki, zahmetli yöntemlerden farklı olarak, mevcut son teknoloji RNA-FISH, hedef RNA dizilerinin tamamlayıcısı olan ticari olarak mevcut nükleik asit problarını kullanır ve bu problar Watson-Crick tabaneşleştirmesi 8ile hedeflerine melezlenir. Erken yerinde hibridizasyon teknikleri, Gall ve Pardue tarafından 1969'da kurulan benzer bir protokolü içeriyordu, çünkü bir örnek özellikle bir hedef RNA9'amelezlenen nükleik asit probları ile işlendi. Başlangıçta test radyoaktif veya kolorimetrik algılama kullanılarak gerçekleştirildi; bununla birlikte, 1980'lerde, DNA FISH ve daha sonra RNA FISH'e floresan in situ hibridizasyon (FISH) protokollerinin geliştirilmesi, daha hassas tespite giden yolu ve çoklama potansiyelini10,11'e açtı.
RNA FISH'teki diğer gelişmeler, tek RNA moleküllerini (smFISH)12 , 13tespit etme ve ölçmeyeteneğineyolaçmıştır. Doğrudan algılama, probların kendilerinin floroforlarla etiket edildiği bir yöntemdir. SmFISH ile ilgili bir zorluk, floresan sinyallerin farklı, kırınım sınırlı noktalar olarak algılanmasını kolaylaştırmak için yeterli melezleme problarına / hedefine ihtiyaç olmasıdır. Bu sorunu gidermek için, hedef RNA 8,12,14'ünçeşitli bölgelerine tamamlayıcıkısa tek iplikli DNA oligonükleotidlerinden oluşan bir prob kümesi kullanılabilir. Birden fazla probun bağlanması yerel florofor yoğunluğunu arttırır ve RNA'yı floresan mikroskopi ile belirgin, yüksek yoğunluklu bir nokta olarak görünür hale getirir. Bu yöntem avantajlıdır, çünkü prob kümesi havuzundaki oligonükleotidlerin hedef dışı bağlanması, gerçek sinyal ve sahte oligonükleotid bağlama arasında ayrım yapmak için spot boyutunu ve yoğunluğunu nicel olarak analiz ederek gerçek RNA spot sinyalinden ayırt edilebilir, böylece yanlış pozitifleri azaltarak daha doğru analizleri kolaylaştırır12.
mRNA'yı tespit etmek için alternatif yöntemler klasik BAC klon tabanlı nick çeviri yöntemi ve daha yeni geliştirilen dallı DNA sistemidir. BAC klonlanmış, nick çeviri yönteminde, etiketlenecek DNA enzimmatik olarak çalınır ve maruz kalan 3' uca yeni bir nükleotid eklenir. DNA polimerazının aktivitesi I, istenen prob15 , 16ile sonuçlanan etiketli bir nükleotid ekler. Dallı DNA tekniği, RNA hedeflerine çiftler halinde melezlenen oligonükleotid probları içerir ve bu problar birden fazla sinyal amplifikasyon molekülü kullanılarak yükseltilir. Bu yöntem sinyal-gürültü oranını önemli ölçüde artırabilir, ancak floresan lekeler boyut ve yoğunluk bakımından çılgınca farklı olabileceğinden amplifikasyon doğru miktarlamayı çarpıtabilir17.
Galveston Körfezi/Houston Gemi Kanalı'nda endokrin bozucu kimyasalların etkilerini ölçmek için NIEHS Superfund Araştırma Programı katılımının bir parçası olarak tam olarak kullanılan bu protokol için bir model sistem olarak, bir ER agonisti, 17β-estradiol (E2) 7 ,18,19 ile bir gecede tedavi edilen östrojen reseptör (ER) pozitif meme kanseri hücre hattı MCF-7'yi kullandık. E2, prototipik ER hedef geni, GREB17, 20,21,22dahil olmak üzere birçok ER-hedef geni düzenler. Burada açıklanan smFISH protokolü, GREB1'i hedefleyen iki spektral olarak ayrılmış prob kümesinden yararlanır; biri akonlara ve diğeri intronlara melezlenerek hem olgun hem de nascent RNA7'ninölçülenliğine izin verir. Daha sonra görüntü smFISH etiketli örneklere dekonvolüsiyon ile birlikte epifluoresans mikroskopisi kullanıyoruz ve ardından hücre başına aktif alel ve olgun RNA'ların sayısını ölçmek için görüntü analizi rutinleri uyguluyoruz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:572px;" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">17&#946; Estradiol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E2257</td>
			<td style="width:167px;">CAS Number 50-28-2</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Ambion SSC (20X) Buffer, Rnase-free</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM9770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Corning DMEM with L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MT10017CV</td>
			<td>Manufactured by Invitrogen</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8417</td>
			<td>Without sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dextran Sulfate, 50% Solution Sterile</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">3730-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline Ca++/Mg++</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21030CV</td>
			<td>Manufactured by Calbiochem</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethanol, 200 Proof (100%)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-678-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:119px;">353047</td>
			<td>Manufactured by Decon Laboratories</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS), 500 mL</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-753-2978</td>
			<td>Manufactured by Gemini Bio Products</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">GE Healthcare DeltaVision LIVE High Resolution Deconvolution Microscope</td>
			<td style="width:71px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hyclone Water, Molecular Biology Grade</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SH3053802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Immersion Oil 1.516</td>
			<td style="width:71px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">29162940</td>
			<td>Manufactured by GE Healthcare Bio-Science</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L-glutamine Solution</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MT25005Cl</td>
			<td>Manufactured by Corning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MCF-7 cells</td>
			<td style="width:71px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Molecular Grade Formamide</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">PAH5051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Olympus 60x/1.42 NA Objective</td>
			<td style="width:71px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Parafilm</td>
			<td style="width:71px;">Bemis Company, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">52858-076</td>
			<td>Distributed by VWR</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade</td>
			<td style="width:71px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicilin-Streptomycin Solution</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MT3001Cl</td>
			<td>Manufactured by Corning</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ribonucleoside Vanadyl Complex</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">101229-716</td>
			<td>Manufactured by New England Biosciences</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RNase Away</td>
			<td style="width:71px;">Ambion</td>
			<td align="right" style="width:119px;">9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium pyruvate, 100 mM</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-360-070</td>
			<td>Manufactured by Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thermo Scientific Glass Coverslips, #1.5</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-545-81P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Triton X-100, 100 mL</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP151-100</td>
			<td>Manufactured by Fisher BioReagents</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA Solution 0.25%</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T4049-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectashield Antifade Mounting Medium 10 mL</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC9265087</td>
			<td>Manufactured by Vector Laboratories</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell analysis of transcriptionally active alleles by single molecule fish

Gen transkripsiyon, hücre biyolojisinde önemli bir süreçtir ve hücrelerin iç ve dış ipuçlarını yorumlamasına ve yanıt vermesine izin verir. mRNA düzeylerini ölçen geleneksel toplu popülasyon yöntemleri (Kuzey blot, PCR ve RNAseq), yanıtlarda hücreden hücreye varyasyon hakkında bilgi sağlama yeteneğinden yoksundur. Hassas tek hücreli ve alelik görselleştirme ve niceleme, tek moleküllü RNA floresan in situ hibridizasyon (smFISH) ile mümkündür. RNA-FISH, hedef RNA'ların etiketli oligonükleotid problarla hibridize ederek gerçekleştirilir. Bunlar orta/yüksek aktarım hızı yöntemleriyle görüntülenebilir ve görüntü analizi işlem hatları aracılığıyla, hem olgun hem de nascent RNA'lar üzerinde tek hücre düzeyinde nicel veriler sağlar. Fiksasyon, permeabilizasyon, hibridizasyon ve görüntüleme adımları, burada açıklanan model sistemi kullanılarak laboratuvarda uzun yıllar boyunca optimize edilmiştir ve bu da smFISH etiketlemesinin başarılı ve sağlam tek hücre analizi ile sonuçlanır. Numune hazırlama ve işleme ile temel amaç, yanlış pozitifleri azaltmak ve daha doğru veriler sağlamak için yüksek sinyal-gürültü oranı ile karakterize yüksek kaliteli görüntüler üretmektir. Burada, belirli örneklere uyarlamak için öneriler ve optimizasyon adımlarıyla birlikte numune hazırlamadan veri analizine kadar işlem hattını açıklayan bir protokol sunuyoruz.

SmFISH yoluyla hormonal yanıtları analiz etmek için, örnek olarak, NIEHS Superfund Araştırma Programı7'yekatılım bağlamında çevre felaketlerinde endokrin bozucu kimyasalların varlığını belirlemek için yüksek verim testlerinde kullanılan östrojen reseptör (ER) modelini seçtik. Bu deneyde, bağlı MCF-7 meme kanseri hücreleri 24 saat boyunca ER agonist 17β-estradiol (E2, 10 nM) veya araç (DMSO) ile tedavi edildi. GREB1 intronic (Atto 647N, Şekil 1'de</...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH at JoVE.com

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Tek moleküllü RNA floresan in situ hibridizasyon (smFISH), belirli RNA'ların seviyelerini ve lokalizasyonunu tek hücre düzeyinde doğru bir şekilde ölçmek için bir yöntemdir. Burada, belirli RNA'ların tek hücreli nicelleştirilmesi için ıslak tezgah işleme, görüntüleme ve görüntü analizi için onaylanmış laboratuvar protokollerimizi rapor ediyoruz.

Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

single-cell-analysis-transcriptionally-active-alleles-single-molecule

Research

JoVE Journal

Biochemistry

3.1K Görüntüleme.  GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics. Tek moleküllü RNA floresan in situ hibridizasyon (smFISH), belirli RNA'ların seviyelerini ve lokalizasyonunu tek hücre düzeyinde doğru bir şekilde ölçmek için bir yöntemdir. Burada, belirli RNA'ların tek hücreli nicelleştirilmesi için ıslak tezgah işleme, görüntüleme ve görüntü analizi için onaylanmış laboratuvar protokollerimizi rapor ediyoruz.

Video: Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA processing, and telomere elongation. During these processes, various proteins bind and resolve G4 structures to perform their function. As the function of G4 often depends on the stability of its folded structure, it is important to investigate how G4 binding proteins regulate the stability of G4. This work presents a method to manipulate single G4 molecules using magnetic tweezers, which enables studies of the regulation of G4 binding proteins on a single G4 molecule in real time. In general, this method is suitable for a wide scope of applications in studies for proteins/ligands interactions and regulations on various DNA or RNA secondary structures.

A single-molecule magnetic tweezers platform to manipulate G-quadruplexes is reported, which allows for the study of G4 stability and regulation by various proteins.

G-quadruplexes manyetik cımbız tarafından manipülasyon tek molekül

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Biyokimya

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and functions. It gave us the opportunity to explore a multiplicity of biophysical mechanisms, e.g., how bacterial adhesins bind to host surface receptors in more detail. Among other factors, the success of SMFS experiments depends on the functional and native immobilization of the biomolecules of interest on solid surfaces and AFM tips. Here, we describe a straightforward protocol for the covalent coupling of proteins to silicon surfaces using silane-PEG-carboxyls and the well-established N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemistry in order to explore the interaction of pilus-1 adhesin RrgA from the Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) with the extracellular matrix protein fibronectin (Fn). Our results show that the surface functionalization leads to a homogenous distribution of Fn on the glass surface and to an appropriate concentration of RrgA on the AFM cantilever tip, apparent by the target value of up to 20% of interaction events during SMFS measurements and revealed that RrgA binds to Fn with a mean force of 52 pN. The protocol can be adjusted to couple via site specific free thiol groups. This results in a predefined protein or molecule orientation and is suitable for other biophysical applications besides the SMFS.

This protocol describes the covalent immobilization of proteins with a heterobifunctional silane coupling agent to silicon-oxide surfaces designed for the atomic force microscopy based single molecule force spectroscopy which is exemplified by the interaction of RrgA (pilus-1 tip adhesin of S. pneumoniae) with fibronectin.

Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a fluorescent dye and are spotted by a photodetector following their separation. Single molecule fluorescence imaging can provide ultrasensitive protein detection with its ability for visualizing individual fluorescent molecules. However, the application of this powerful imaging method to electrophoresis assays is hampered by the lack of ways to characterize the homogeneity of fluorescent labeling of each protein species across the proteome. Here, we developed a method to evaluate the labeling homogeneity across the proteome based on a single molecule fluorescence imaging assay. In our measurement using a HeLa cell sample, the proportion of proteins labeled with at least one dye, which we termed &#8216;labeling occupancy&#8217; (LO), was determined to range from 50% to 90%, supporting the high potential of the application of single molecule imaging to sensitive and precise proteome analysis.

Here, we present a protocol to assess the labeling homogeneity for each protein species in a complex protein sample at the single molecule level.

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve intracellular structures and the dynamics of biomolecules with ~20 nm precision. A prerequisite for SMLM are fluorophores that transition from a dark to a fluorescent state in order to avoid spatio-temporal overlap of their point spread functions in each of the thousands of data acquisition frames. BODIPYs are well-established dyes with numerous conjugates used in conventional microscopy. The transient formation of red-shifted BODIPY ground-state dimers (DII) results in bright single molecule emission enabling single molecule localization microscopy (SMLM). Here we present a simple but versatile protocol for SMLM with conventional BODIPY conjugates in living yeast and mammalian cells. This procedure can be used to acquire super-resolution images and to track single BODIPY-DII states to extract spatio-temporal information of BODIPY conjugates. We apply this procedure to resolve lipid droplets (LDs), fatty acids, and lysosomes in living yeast and mammalian cells at the nanoscopic length scale. Furthermore, we demonstrate the multi-color imaging capability with BODIPY dyes when used in conjunction with other fluorescent&#160;probes. Our representative results show the differential spatial distribution and mobility of BODIPY-fatty acids and neutral lipids in yeast under fed and fasted conditions. This optimized protocol for SMLM can be used with hundreds of commercially available BODIPY conjugates and is a useful resource to study biological processes at the nanoscale far beyond the applications of this work.&#160;

Conventional BODIPY conjugates can be used for live-cell single-molecule localization microscopy (SMLM) through exploitation of their transiently forming, red-shifted ground state dimers. We present an optimized SMLM protocol to track and resolve subcellular neutral lipids and fatty acids in living mammalian and yeast cells at the nanoscopic length scale.

Canlı Hücresüper çözünürlüklü mikroskopi ve Tek Moleküllü İzleme için Konvansiyonel BODIPY Konjugeleri

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed extensive studies of cap-dependent translation and its regulation, high resolution kinetic characterization of this translation pathway is still lacking. Recently, we developed an in vitro assay to measure cap-dependent translation kinetics with single-molecule resolution. The assay is based on fluorescently labeled antibody binding to nascent epitope-tagged polypeptide. By imaging the binding and dissociation of antibodies to and from nascent peptide&#8211;ribosome&#8211;mRNA complexes, the translation progression on individual mRNAs can be tracked. Here, we present a protocol for establishing this assay, including mRNA and PEGylated slide preparations, real-time imaging of translation, and analysis of single molecule trajectories. This assay enables tracking of individual cap-dependent translation events and resolves key translation kinetics, such as initiation and elongation rates. The assay can be widely applied to distinct translation systems and should broadly benefit in vitro studies of cap-dependent translation kinetics and translational control mechanisms.

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Tracking individual translation events allows for high-resolution kinetic studies of cap-dependent translation mechanisms. Here we demonstrate an in vitro single-molecule assay based on imaging interactions between fluorescently labeled antibodies and epitope-tagged nascent peptides. This method enables single-molecule characterization of initiation and peptide elongation kinetics during active in vitro cap-dependent translation.

Kapak Bağımlı Çeviri Kinetiğinin Analizi için Bir In Vitro Tek Moleküllü Görüntüleme Tahlili

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for hundreds of individual restriction endonuclease (REase) molecules in one experiment. This assay does not require protein labeling and can be carried out with a single imaging channel. In addition, the results of multiple individual experiments can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions. Analysis of the resulting dwell-time distributions can help elucidate the DNA cleavage mechanism by revealing the presence of kinetic steps that cannot be directly observed. Example data collected using this assay with the well-studied REase, EcoRV - a dimeric Type IIP restriction endonuclease that cleaves the palindromic sequence GAT&#8595;ATC (where &#8595; is the cut site) - are in agreement with prior studies. These results suggest that there are at least three steps in the pathway to DNA cleavage that is initiated by introducing magnesium after EcoRV binds DNA in its absence, with an average rate of 0.17 s-1 for each step.

Using quantum-dot-labeled DNA and total internal reflection fluorescence microscopy, we can investigate the reaction mechanism of restriction endonucleases while using unlabeled protein. This single-molecule technique allows for massively multiplexed observation of individual protein-DNA interactions, and data can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions.

Restriksiyon endonükleaz aracılı DNA bölünmesinin tek moleküllü bekleme süresi analizi

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately 20 nm to accommodate large tRNA substrates at the A-, P- and E-sites. Consequently, the ribosome dynamics are naturally de-phased quickly. Single molecule method can detect each ribosome separately and distinguish inhomogeneous populations, which is essential to reveal the complicated mechanisms of multi-component systems. We report the details of a smFRET method based on the Nikon Ti2 inverted microscope to probe the ribosome dynamics between the ribosomal protein L27 and tRNAs. The L27 is labeled at its unique Cys 53 position and reconstituted into a ribosome that is engineered to lack L27. The tRNA is labeled at its elbow region. As the tRNA moves to different locations inside the ribosome during the elongation cycle, such as pre- and post- translocation, the FRET efficiencies and dynamics exhibit differences, which have suggested multiple subpopulations. These subpopulations are not detectable by ensemble methods. The TIRF-based smFRET microscope is built on a manual or motorized inverted microscope, with home-built laser illumination. The ribosome samples are purified by ultracentrifugation, loaded into a home-built multi-channel sample cell and then illuminated via an evanescent laser field. The reflection laser spot can be used to achieve feedback control of perfect focus. The fluorescence signals are separated by a motorized filter-turret and collected by two digital CMOS cameras. The intensities are retrieved via the NIS-Elements software.

Single molecule fluorescence energy transfer is a method that tracks the tRNA dynamics during ribosomal protein synthesis. By tracking individual ribosomes, inhomogeneous populations are identified, which shed light on mechanisms. This method can be used to track biological conformational changes in general to reveal dynamic-function relationships in many other complexed biosystems. Single molecule methods can observe non-rate limiting steps and low-populated key intermediates, which are not accessible by conventional ensemble methods due to the average effect.

Ribozom Protein Sentezinin Tek Molekül floresan Enerji Transferi Çalışması

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 (FET) family of fusion oncoproteins, is one of the most frequently involved fusion genes in Ewing sarcoma. These FET family fusion proteins typically harbor a low-complexity domain (LCD) of FET protein at their N-terminus and a DNA-binding domain (DBD) at their C-terminus. EWS-FLI1 has been confirmed to form biomolecular condensates at its target binding loci due to LCD-LCD and LCD-DBD interactions, and these condensates can recruit RNA polymerase II to enhance gene transcription. However, how these condensates are assembled at their binding sites remains unclear. Recently, a single-molecule biophysics method-DNA Curtains-was applied to visualize these assembling processes of EWS-FLI1 condensates. Here, the detailed experimental protocol and data analysis approaches are discussed for the application of DNA Curtains in studying the biomolecular condensates assembling on target DNA.

Here, we describe the use of the single-molecule imaging method, DNA Curtains, to study the biophysical mechanism of EWS-FLI1 condensates assembling on DNA.

DNA Üzerine Birleştirilen EWS-FLI1 Kondensatlarının Tek Moleküllü Görüntülenmesi

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved single-molecule studies and has gained immense popularity in detecting and understanding the dynamic behavior of fluorescent-tagged molecules. Here, we describe a detailed method for&#160;in vitro single-molecule studies of kinesin-3 family motors using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy. Kinesin-3 is a large family that plays critical roles in cellular and physiological functions ranging from intracellular cargo transport to cell division to development. We have shown previously that constitutively active dimeric kinesin-3 motors exhibit fast and superprocessive motility with high microtubule affinity at the single-molecule level using cell lysates prepared by expressing motor in mammalian cells. Our lab studies kinesin-3 motors and their regulatory mechanisms using cellular, biochemical and biophysical approaches, and such studies demand purified proteins at a large scale. Expression and purification of these motors using mammalian cells would be expensive and time-consuming, whereas expression in a prokaryotic expression system resulted in significantly aggregated and&#160;inactive protein. To overcome the limitations posed by bacterial purification systems and mammalian cell lysate, we have established a robust Sf9-baculovirus expression system to express and purify these motors. The kinesin-3 motors are C-terminally tagged with 3-tandem fluorescent proteins (3xmCitirine or 3xmCit) that provide enhanced signals and decreased photobleaching. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of Sf9 purified proteins demonstrate that kinesin-3 motors are fast and superprocessive akin to our previous studies using mammalian cell lysates. Other applications using these assays include detailed knowledge of oligomer conditions of motors, specific binding partners paralleling biochemical studies, and their kinetic state.

This study details purification of KIF1A(1-393LZ), a member of kinesin-3 family, using Sf9-baculovirus expression system. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of these purified motors exhibited robust motility properties comparable to motors from mammalian cell lysate. Thus, Sf9-baculovirus system is amenable to express and purify motor protein of interest.

Sf9 Saflaştırılmış Süperprosesif Kinesin-3 Ailesi Motorlarının Tek Moleküllü Analizi

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction with lipids employ naked bilayer membranes. Such systems lack the complexities of crowding by membrane-embedded proteins and glycans and exclude the associated volume effects encountered on cellular membrane surfaces. Also, the negatively charged glass surface onto which the lipid bilayers are formed prevents the free diffusion of transmembrane biomolecules. Here, we present a well-characterized polymer-lipid membrane as a mimic for crowded lipid membranes. This protocol utilizes polyethylene glycol (PEG)-conjugated lipids as a generalized approach for incorporating crowders into the supported lipid bilayer&#160;(SLB). First, a cleaning procedure of the microscopic slides and coverslips for performing single-molecule experiments is presented. Next, methods for characterizing the PEG-SLBs and performing single-molecule experiments of the binding, diffusion, and assembly of biomolecules using single-molecule tracking and photobleaching are discussed. Finally, this protocol demonstrates how to monitor the nanopore assembly of bacterial pore-forming toxin Cytolysin A (ClyA) on crowded lipid membranes with single-molecule photobleaching analysis. MATLAB codes with example datasets are also included to perform some of the common analyses such as particle tracking, extracting diffusive behavior, and subunit counting.

Here, a protocol to perform and analyze the binding, mobility, and assembly of single molecules on artificial crowded lipid membranes using single-molecule total internal reflection fluorescence (smTIRF) microscopy is presented.

Tek Moleküllü Difüzyon ve Polimer Kalabalık Lipid Membranlara Montaj

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction ...