MAM, FS und MGM werden von NIEHS gefördert (Project 4, P42ES027704, PI, Rusyn). MAM, FS, RMM, MGM und PKS werden vom CPRIT-finanzierten GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics (RP170719) unterstützt. Die Bildgebung wird auch vom Integrated Microscopy Core am Baylor College of Medicine mit Mitteln von NIH (DK56338 und CA125123), CPRIT (RP150578), dem Dan L. Duncan Comprehensive Cancer Center und dem John S. Dunn Gulf Coast Consortium for Chemical Genomics unterstützt.

Um optimale Ergebnisse zu gewährleisten, erfordert der Nasslaborteil dieses Protokolls standard-RNase-freie Vorsichtsmaßnahmen bei allen Schritten. Zum Beispiel wird die Verwendung von gefilterten Pipettenspitzen, sterilen Gefäßen und RNase-freien Puffern dringend empfohlen. Die Verwendung von RNase-Inhibitoren wie Vanadyl-Ribonukleosid-Komplexen wird ebenfalls empfohlen, insbesondere für Ziel-RNAs mit geringer Häufigkeit.
1. Zellkultur und Versuchsaufbau
<ol><li>Halten Sie adhärente MCF-7-Brustkrebszellen (ATCC #HTB-22) in einem T75-Gewebekulturkolben mit phenolrotfrei (nur für Hormonstimulationsexperimente erforderlich) Dulbeccos modifiziertem Eagle's Medium (DMEM) mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 1 nM Natriumpyruvat, 50 I.E./ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin.</li>
	<li>Säuregeätzte, poly-D-lysinbeschichtete runde Decklippen (0,16 bis 0,19 mm dick, 12 mm Durchmesser) in eine 24-Mehrwell-Gewebekulturplatte geben. HINWEIS: Verwenden Sie 1 M HCl, um die Deckschichten mit Säure zu ätzen und mit einer 1 mg / ml Lösung von Poly-D-Lysin zu beschichten, die in sterilem PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Ca++ und Mg++) gemäß Standardprotokollen rekonstituiert ist.</li>
	<li>Entfernen Sie die Wachstumsmedien aus den Zellen und waschen Sie sie einmal mit 5 mL sterilem PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohneCa++ undMg++). McF-7-Zellen mit 2-3 ml Trypsin-EDTA 0,25% iger Lösung lösen. Sobald sich die Zellen gelöst haben, neutralisieren Sie die Trypsin-EDTA 0,25% ige Lösung mit einem gleichen Volumen an Wachstumsmedien.</li>
	<li>Die Zellen in der Mediensuspension in ein 15 mL konisches Rohr geben, bei 391 x g für 1 Minute herunterdrehen, um die Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie die Medien vorsichtig aus dem konischen Röhrchen, ohne das Zellpellet zu stören, und resuspendieren Sie die Zellen in einer angemessenen Menge an Behandlungsmedien. HINWEIS: Das Behandlungsmedium ist phenolrotfreies DMEM, ergänzt mit 5% Holzkohle-Dextran-gestreiften und dialysierten FBS, 2 mM L-Glutamin, 1 nM Natriumpyruvat, 50 I.E./ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin. Dieses Medium ist für Steroidhormonstimulationsexperimente unerlässlich, da die Serumkomponente durch Holzkohleabisolierung der Medien weitgehend von Steroiden erschöpft ist und wachstumsfaktoren durch Dialyse reduziert hat.</li>
	<li>Säen Sie die Zellen auf Coverlips in der 24-Multiwell-Platte bei 60.000 bis 70.000 Zellen pro Vertiefung in 500 μL Behandlungsmedien. Für dieses Experiment sollte die Zellkonfluenz zu Beginn der Behandlung bei etwa 70-80% liegen. Optimieren Sie die Zellaussaatdichte in Abhängigkeit von Zelltyp, Wachstumsrate und Länge des Experiments, um Konfluenz zu vermeiden, was die Bildanalyse erschwert. HINWEIS: Für eine optimale Bildgebung und Bildanalyse vermeiden Sie Zellverklumpung. Zu diesem Zweck mischen Sie das Aliquot der Zellen gründlich, indem Sie die Zellen einige Male pipettieren (oder kurz vortexen), bevor Sie sie in die Vertiefungen dosieren. Bevor die plattierten Zellen wieder in den Inkubator gelegt werden, können die Zellen für etwa 20 Minuten in der Gewebekulturhaube absetzen, um die Zellverklumpung zu reduzieren.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen mindestens zwei Tage vor der Behandlung, um die Synchronisation des Zellzyklus und die Hintergrundreduktion aufgrund von Signalmolekülen, die im gestreiften / dialysierten Serum von Wachstumsmedien verbleiben, sicherzustellen.</li>
	<li>Nach einer 48-stündigen Inkubation in Behandlungsmedien behandeln Sie MCF-7-Zellen mit 10 nM 17β-Estradiol (E2) und Vehikelkontrolle (DMSO), die 24 Stunden lang in Behandlungsmedien verdünnt wurden. Diese Behandlung verwendet eine sättigende Dosis von E2, um eine maximale Reaktion zu induzieren. Führen Sie Zeitverlaufs- und Dosis-Wirkungs-Experimente durch, um die Bedingungen für verschiedene Zielgene, Zellmodelle und Behandlungstypen empirisch zu bestimmen. Als Beispiel sehen Sie unsere aktuelle Publikation7.</li>
</ol>2. Vorbereitung von Puffern
<ol><li>Zur Herstellung des Fixationspuffers wird gereinigtes, monomeres Formaldehyd (von Elektronenmikroskopie-Lieferanten als 16% Paraformaldehyd verkauft) auf 4% in sterilem PBSCa++/Mg++ (phosphatgepufferte Kochsalzlösung plusCa++ undMg++)verdünnt. Fügen Sie Vanadyl-Ribonukleosid-Komplexe (VRC) zum Fixationspuffer für eine Endkonzentration von 2 mM hinzu, um den RNA-Abbau zu verzögern.<ol>
<li>Berechnen Sie die Gesamtmenge des Fixationspuffers basierend auf dem Bedarf von 300-500 μL Fixiermittel pro Vertiefung einer 24-Multiwell-Platte. Lagern Sie das 4% Formaldehyd auf Eis, bis es im Fixierungsschritt erforderlich ist. HINWEIS: Machen Sie den Fixierungspuffer für jedes Experiment neu. ACHTUNG: Formaldehyd ist ein Teratogen, das über die Haut aufgenommen wird. Verwenden Sie diese Chemikalie in einem Abzug zusammen mit geeigneten PSA gemäß Ihren institutionellen Vorschriften.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Für den Permeabilisierungsschritt bereiten Sie 70% Ethanol in nukleasefreiem Wasser vor. Eine alternative Option ist 0,5% Triton-X100 in sterilem PBS Ca++/ Mg++ plus 2 mM VRC. Berechnen Sie die Gesamtmenge des benötigten Permeabilisierungspuffers, indem Sie 500 μL Puffer pro Bohrstück verwenden.</li>
	<li>Um 9 mL des Hybridisierungspuffers vorzubereiten, fügen Sie 2 mL 50% Dextransulfat und 1 ml 20x SSC-Puffer (salzhaltiges Natriumcitrat) zu 6 ml nukleasefreiem Wasser hinzu. Vortex, um den Hybridisierungspuffer gründlich zu mischen. Dieser Puffer kann bis zu einer Woche bei 4 °C gelagert werden.</li>
	<li>Es gibt fünf separate Waschschritte, die einen 2x salzhaltigen Natriumcitratpuffer (SSC) erfordern. Berechnen Sie das endgültige Volumen des benötigten 2x SSC-Puffers, indem Sie 500 μL Puffer pro Abdecklappen und Waschschritt antizipieren. Verdünnen Sie die erforderliche Menge an Füllmaterial 20x SSC-Puffer in nukleasefreiem Wasser. 2 mM VRC kann als zusätzliche Vorsichtsmaßnahme zu Waschschritten hinzugefügt werden. Dieser Puffer kann für die Dauer der Verarbeitungsschritte bei Raumtemperatur gelagert werden.</li>
</ol>3. Fixierung für RNA FISH
<ol><li>Nach der Behandlung das Medium aus den Vertiefungen nehmen und einmal mit sterilem, kaltem PBSCa++/Mg++waschen. Wenn ein Zellmodell mit geringer Adhärenz verwendet wird, verwenden Sie kein Vakuum, um Flüssigkeit anzusaugen. Verwenden Sie manuelles Pipettieren, um Medien vorsichtig von der Seite des Brunnens zu entfernen und den ersten Waschschritt zu unterlassen. Fügen Sie 500 μL Fixationspuffer für 30 Minuten auf Eis hinzu. HINWEIS: Wenn die Probe anfällig für RNA-Abbau ist, verwenden Sie steriles PBS mit 2 mM VRC für den Waschschritt an dieser Stelle.</li>
	<li>Entfernen Sie Fixiermittel und entsorgen Sie es in chemischen Abfällen gemäß den institutionellen Vorschriften. Waschen Sie die Zellen zweimal mit kaltem sterilem PBS Ca++/ Mg++ für 3 Minuten.</li>
	<li>Entfernen Sie PBS und fügen Sie 500 μL 70% Ethanol zu jeder Vertiefung hinzu. Versiegeln Sie die 24-Well-Platte mit einer Paraffin-Kunststofffolie. Mindestens vier Stunden lang bei 4 °C auf einen Rotator legen. Es ist am besten, die Proben über Nacht in 70% Ethanol zu lassen. Das Protokoll kann an dieser Stelle pausiert werden und die Proben können bis zu einer Woche in 70% Ethanol gelagert werden. HINWEIS: Alternativ kann ein 0,5% Triton-X100 in PBS mit 2 mM VRC-Lösung verwendet werden. Inkubieren Sie die Proben in 500 μL dieses Permeabilisierungspuffers für 20 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Rotator. Bei Verwendung dieses Permeabilisierungspuffers kann das Protokoll an dieser Stelle nicht angehalten werden und muss den Hybridisierungsschritt durchlaufen.</li>
</ol>4. Hybridisierung für RNA FISH
<ol><li>Entfernen Sie den Permeabilisierungspuffer und waschen Sie ihn einmal in 500 μL 2x SSC-Puffer plus 10% Formamid für 5 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Rotator.</li>
	<li>Bereiten Sie den vollständigen Hybridisierungspuffer vor. Berechnen Sie ca. 30 μL vollständigen Hybridisierungspuffer pro Coverslip. Fügen Sie Formamid zum Hybridisierungspuffer hinzu, um den erforderlichen Prozentsatz zu erreichen. Wenn beispielsweise 500 μL vollständiger Hybridisierungspuffer benötigt werden, dann würde er aus 450 μL des zuvor hergestellten Hybridisierungspuffers plus 50 μL molekularem Formamid bestehen, um 10% vol / vol zu erreichen. Vortex kurz zu mischen. ACHTUNG: Formamid ist ein Teratogen, das über die Haut aufgenommen wird. Verwenden Sie diese Chemikalie in einem Abzug zusammen mit geeigneten PSA gemäß den institutionellen Vorschriften.</li>
	<li>Verdünnen Sie die SONDEN GREB1 Intron (markiert mit Atto 647N) und GREB1 Exon (markiert mit Quasar 570) 1:300 im Hybridisierungspuffer. Mischen Sie durch Pipettieren. Schützen Sie diesen Puffer vor Licht und verwenden Sie ihn sofort. HINWEIS: Die Sonden wurden wie in Stossi et al7 beschriebenentworfen und hergestellt. Die Sonden werden in der Regel als getrockneter Oligonukleotid-Sondenpool bereitgestellt, der gemäß Herstellerprotokoll14in RNAse-freiem TE-Puffer rekonstituiert werden muss. Die Stammlösung für diese Sonden betrug daher 12,5 μM; die Arbeitskonzentration der Sonden beträgt 42 nM.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Befeuchtungskammer für den Hybridisierungsschritt über Nacht vor. Legen Sie ein Stück Paraffin-Kunststofffolie, unbelichtet, mit der Seite nach oben in eine Glas-Petrischale, die mit einem Oberflächendekontaminationsmittel gereinigt wird, um RNases zu entfernen. Sättigen Sie zwei Papiertücher mit sterilem Wasser und legen Sie sie an den Rändern der Petrischale, um Feuchtigkeit zu spenden, da das Trocknen bestimmte Etiketten zerstören kann.</li>
	<li>Aliquotieren Sie die Sonden, indem Sie 30 μL Sonden im Hybridisierungspuffer auf die saubere Seite der Paraffin-Kunststofffolie punktieren. Verteilen Sie die Aliquoten der Sonden so, dass die Abdeckungsrutsche nicht miteinander in Berührung kommen.</li>
	<li>Drehen Sie mit einer sterilisierten Zette die Abdeckzellenseite vorsichtig auf die Sonden in der Glas-Petrischale. Vermeiden Sie Luftblasen und drücken Sie die Abdeckfolien nicht aus. HINWEIS: Entsorgen Sie die Gewebekulturplatte nicht mit dem 2x SSC-Puffer, da sie für nachfolgende Schritte benötigt wird.</li>
	<li>Versiegeln Sie die Glas-Petrischale mit Paraffin-Kunststofffolie und bedecken Sie die Platte mit Folie, um eine Lichteinwirkung gegenüber den Fluorophoren zu verhindern. Über Nacht bis zu 16 Stunden bei 37 °C auf einer flachen, nicht rotierenden Oberfläche inkubieren. Die Inkubationszeit kann empirisch variiert werden, es wird jedoch ein Minimum von 4 Stunden empfohlen. HINWEIS: Die Coverlips sind anfällig für das Rutschen beim Inkubieren im Hybridisierungspuffer, was zu trockenen Stellen auf dem Coverslip führen und die Probe beschädigen kann.</li>
</ol>5. Proben für die Bildgebung vorbereiten 
<ol><li>Am nächsten Tag entfernen Sie die Abdeckungsrlips mit einer Zette aus der Befeuchtungskammer und bringen sie mit der Zellseite nach oben auf die 24-Well-Platte zurück. Fügen Sie 500 μL frischen 2x SSC-Puffer plus 10% Formamid hinzu, um überschüssige Sonde und unspezifische Hybridisierung auszuwaschen. HINWEIS: Schützen Sie die Proben ab diesem Zeitpunkt vor Licht.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen zweimal mit 500 μL 2x SSC-Puffer plus 10% Formamid für jeweils 15 Minuten bei 37°C auf einem beheizten Rotator.</li>
	<li>Gegenfärbung von DNA mit DAPI bei 1 μg/ml in 2x SSC-Puffer für 10 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Rotator.</li>
	<li>Einmal mit 2x SSC-Puffer für 5 Minuten bei Raumtemperatur waschen.</li>
	<li>Montieren Sie die Abdeckrlips mit nicht härtenden Montagemedien auf Glasträger, nachdem Sie überschüssigen 2x SSC-Puffer mit einem Papiertuch und einem schnellen Waschen in nukleasefreiem Wasser entfernt haben, um überschüssige Salze zu entfernen. Zum Schluss die Abdecklippen mit klarem Nagellack versiegeln.</li>
</ol>6. Hochauflösende Mikroskopie und Bildverarbeitung
<ol><li>Stellen Sie die Proben auf einem Weitfeld-Epifluoreszenzmikroskop mit einem 60- oder 100-fachen Ölobjektiv und einer sCMOS-Kamera ab. Siehe die Materialtabelle für das spezifische Mikroskop und objektiv, das für dieses Experiment verwendet wurde.<ol>
<li>Vollständige Bildgebung, sobald die Proben vollständig verarbeitet sind, um eine zeitabhängige Verschlechterung des Signals zu vermeiden. HINWEIS: In diesem Experiment wird Tauchöl mit einem Brechungsindex (RI) von 1,516 verwendet. Empirische Tests sollten durchgeführt werden, um den Öl-RI bestimmten Proben zuzuordnen, da RI-Diskrepanzen zu Aberrationen der Punktspreizfunktion führen, die sich auf die Bilddekonvolution auswirken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Bilder werden mit einer seitlichen Pixelgröße von 0,10827 μm aufgenommen.</li>
	<li>Optimieren Sie die Beleuchtungsstärke der Lichtquelle (d. h. die prozentuale Durchlässigkeit) und die Belichtungszeiten für jeden Kanal (DAPI-, TRITC-, CY5-Filter in diesem speziellen Beispiel) mit der Probe, die voraussichtlich die höchste Intensität aufweist (d. h. positive Kontrollen). In diesem Experiment wird erwartet, dass die E2-behandelte Probe für beide GREB1-Sondensätze eine höhere Intensität aufweist. Im Allgemeinen beträgt die prozentuale Transmission für GREB1-Intron- und Exonsonden 50 – 100% und die Belichtungszeiten liegen zwischen 0,25 und 0,60 Sekunden.</li>
	<li>Darüber hinaus können Sie Bilder unter Bedingungen erfassen, die Photobleaching und/oder eine Sättigung der Kamerapixel vermeiden. Unserer Erfahrung nach sollte es einen mindestens zehnfachen Unterschied zwischen dem Hintergrund und der Signalintensität geben. Eine Sättigung von wenigen Pixeln/Feld kann aufgrund unspezifischer Signale in der Probe auftreten (z. B. Schmutz auf dem Coverlip, Sondenaggregate außerhalb der Zelle), was akzeptabel sein kann, aber nur, wenn gesättigte Bereiche nicht in die Quantifizierung einbezogen werden.</li>
	<li>Um die Erfassung eines Z-Stacks festzulegen, konzentrieren Sie sich auf das Sample im DAPI-Kanal. Wählen Sie die Ober- und Unterseite des Z-Stapels in den Abständen aus, in denen die DAPI-gefärbten Kerne unsauch werden. Die von uns verwendete z-Stack-Schrittgröße beträgt 0,25 μm pro Slice und der gesamte z-Stack sollte die gesamte Zelle umfassen (ca. 10 μm in MCF-7-Zellen). Die Z-Stack-Schrittgröße ändert sich jedoch je nach verwendetem Objektiv und sollte dem Nyquist-Stichprobenkriterium folgen. HINWEIS: Introns sind normalerweise nur im Kern vorhanden; Exons befinden sich jedoch sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma. Wenn Sie den Z-Stack wie oben beschrieben einstellen, erfasst er daher den größten Teil der Intron- und Exon-Markierung, da der Z-Stack die gesamte Zelle umfasst.</li>
	<li>Bilden Sie in der Regel mindestens 200 Zellen für die quantitative Analyse in vorläufigen Experimenten ab, um eine Momentaufnahme des Ausmaßes der Reaktion und Variation zwischen den Zellen zu erfassen.</li>
	<li>Einige abgebildete Zellen werden von der endgültigen Analyse ausgeschlossen (d. h. die Abbruchrate), da sie von der Analysepipeline herausgefiltert werden (d. h. Zellen, die den Rahmen des Bildes berühren, apoptotische/mitotische Zellen). HINWEIS: Bei der Auswahl von Bildbereichen sind einige Faktoren zu beachten. Wählen Sie Bereiche mit gleichmäßig verteilten, nicht überlappenden Zellen, wie sie durch DAPI-markierte Kernfluoreszenz definiert sind. Versuchen Sie außerdem, Bereiche auszuwählen, die die geringste Anzahl von Kernen entlang der Ränder des Bildbereichs aufweisen, um das Zählen von Teilzellen zu vermeiden. Automatisierte, unvoreingenommene Bildgebung wird immer für Experimente bevorzugt, die eine statistische Analyse erfordern.</li>
	<li>Devolvieren Sie bilder nach der Aufnahme mit einem aggressiven restaurativen Algorithmus mit 10 Zyklen (d. H. Anzahl der Iterationen). Generieren Sie Projektionen mit maximaler Intensität für die Bildanalyse (lassen Sie diesen Schritt weg, wenn eine spezifische 3D-Analyse erforderlich ist). Speichern Sie alle Projektionsbilder entsprechend der Bittiefe der verwendeten Kamera; in unserem Fall wurden 16-Bit-TIFF-Graustufenbilder gespeichert. RGB-Bilder haben eine reduzierte Bittiefe, was zu einem Informationsverlust führt. DAHER sind RGB-Bilder nicht für die Bildanalyse geeignet.</li>
</ol>7. Bildanalyse 
<ol><li>Lesen Sie die Anleitung und laden Sie das Jupyter-Notebook von github herunter (https://github.com/pankajmath/RNA_FISH_analysis).</li>
	<li>Installieren Sie die Python anaconda-Distribution (https://www.anaconda.com/distribution/) Version 3.6 oder höher.</li>
	<li>Öffnen Sie die Eingabeaufforderung anaconda und geben Sie den Installationsbefehl install simple ITK for anaconda ( https://anaconda.org/SimpleITK/simpleitk )ein.</li>
	<li>Öffnen Sie anaconda navigator und starten Sie jupyter notebook. Es öffnet sich ein Webbrowser mit Verzeichnissen und Dateien. Durchsuchen Sie die Verzeichnisstrukturen, um zu dem Verzeichnis zu gelangen, das das heruntergeladene Jupyter-Notebook von github enthält.</li>
	<li>Öffnen Sie das Notizbuch und führen Sie jede Zelle aus, indem Sie gleichzeitig die Umschalttaste und die Eingabetaste drücken.</li>
	<li>Befolgen Sie die Details der einzelnen Funktionen und Schritte im Notizbuch. Für einen anderen Satz von Bildern muss man möglicherweise einige Parameterwerte ändern. HINWEIS: Kurz gesagt, Kerne werden aus dem DAPI-Kanal mit lokalem Schwellenwert mit einer Blockgröße von 251 Pixeln segmentiert, Löcher wurden gefüllt und Objekte kleiner als 100 Pixel entfernt. Berührende Kerne wurden mit einem Wassereinzugsgebietsalgorithmus gespalten. Die Kernmaske wurde dann um 100 Pixel erweitert und die Wasserscheide wurde verwendet, um berührende Objekte mit Kernen als Becken zu trennen. Um Steady-State-RNA (Exons) zu identifizieren, wurde Otsu-Schwellenwerte verwendet; für transkriptionelle aktive Allele (Intron) wurde zunächst eine Gaußsche Unschärfe (Sigma=1) angewendet und dann die maximale Entropieschwelle verwendet.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Die beschriebene smFISH-Methodik basiert auf den zuvor veröffentlichten Protokollen7,12,14. In diesem Protokoll erklären wir die kritischen Schritte, die vom Nasslabor (einschließlich Seeding-Dichte, Fixierungszeit, Permeabilisierung und Sondenkonzentration) bis hin zur Bildgebung und Bildanalyse optimiert wurden, um eine vollständige experimentelle Pipeline für Labore bereitzustellen, die an der Durchführung von Einzelzel...

Gentranskription und -translation sind die beiden Hauptprozesse, die am zentralen Dogma der Biologie beteiligt sind und von der DNA-Sequenz über RNA bis hin zu Protein1reichen. In dieser Studie konzentrieren wir uns auf die Produktion von Boten-RNA (mRNA) während der Transkription. Das entstehende RNA-Molekül umfasst sowohl nicht-kodierende Introns als auch kodierende Exons. Introns werden co-transkriptionell ausgespleißt, bevor sich die mRNA zur Translation auf die Ribosomen2,3in das Zytoplasma bewegt.
Traditionell wird die Messung von mRNA in Massenpopulationen von Zellen (Hunderte bis Millionen) mit klassischen Assays wie RT-qPCR oder Northern Blotting durchgeführt. Obwohl diese Methoden sehr leistungsfähig sind, sind sie begrenzt, da sie keine Einblicke in die Zell-zu-Zell-Variation (phänotypische Heterogenität), die Identifizierung der Anzahl der transkriptionell aktiven Allele und, was vielleicht noch wichtiger ist, den Mangel an räumlichen Informationen liefern. In jüngerer Zeit begannen genomweite Technologien, die eine Einzelzell-RNA-Sequenzierung (RNAseq) ermöglichen, die Lücke zwischen bildgebenden Verfahren und Sequenzierung zu schließen4. RNAseq leidet jedoch unter relativ geringen Erkennungseffizienzen und die Verarbeitungsschritte führen zum vollständigen Verlust räumlicher Informationen5. Obwohl Einzelzell-RNAseq Einblicke in die phänotypische Heterogenität einer Population isogener Zellen liefern kann, kann die RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (RNA-FISH) eine vollständigere Untersuchung der Zielgenexpression auf räumlicher Ebene und auf Allel-für-Allel-Basis ermöglichen6,7.
RNA FISH ist eine Technik, die den Nachweis und die Lokalisierung von Ziel-RNA-Molekülen in festen Zellen ermöglicht. Im Gegensatz zu früheren, mühsamen Methoden verwendet das derzeit hochmoderne RNA-FISH kommerziell verfügbare Nukleinsäuresonden, die die Ziel-RNA-Sequenzen ergänzen, und diese Sonden hybridisieren durch Watson-Crick-Basenpaarung8zu ihren Zielen. Die frühen In-situ-Hybridisierungstechniken beinhalteten ein ähnliches Protokoll, das 1969 von Gall und Pardue festgelegt wurde, als eine Probe mit Nukleinsäuresonden verarbeitet wurde, die spezifisch zu einer Ziel-RNA9hybridisiert wurden. Ursprünglich wurde der Assay mittels radioaktiver oder kolorimetrischer Detektion durchgeführt; In den 1980er Jahren eröffnete jedoch die Entwicklung von Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsprotokollen (FISH) zu DNA FISH und später RNA FISH den Weg zu empfindlicheren Nachweisen und das Potenzial für multiplexing10,11.
Weiterentwicklungen in RNA FISH haben dazu geführt, dass einzelne RNA-Moleküle (smFISH) nachgewiesen und quantifiziert werdenkönnen 12,13. Der direkte Nachweis ist eine Methode, bei der die Sonden selbst mit Fluorophoren markiert werden. Eine Herausforderung bei smFISH besteht darin, dass genügend hybridisierende Sonden/ Target benötigt werden, um die Detektion von fluoreszierenden Signalen als ausgeprägte, beugungsbegrenzte Flecken zu erleichtern. Um dieses Problem zu lösen, kann man einen Sondensatz von kurzen einzelsträngigen DNA-Oligonukleotiden verwenden, die sich komplementär zu verschiedenen Regionen der Ziel-RNA8,12,14ergänzen. Die Bindung mehrerer Sonden erhöht die lokale Fluorophordichte, wodurch die RNA durch Fluoreszenzmikroskopie als eigenständiger, hochintensiver Spot sichtbar wird. Diese Methode ist vorteilhaft, da die Off-Target-Bindung von Oligonukleotiden im Sondensatzpool vom echten RNA-Spot-Signal unterschieden werden kann, indem die Spotgröße und -intensität quantitativ analysiert wird, um zwischen echter Signal- und falscher Oligonukleotidbindung zu unterscheiden, wodurch eine genauere Analyse durch Reduzierung von Fehlalarmen ermöglicht wird12.
Alternative Methoden zum Nachweis von mRNA sind die klassische BAC-klonbasierte Nick-Translation-Methode und das neu entwickelte verzweigte DNA-System. Bei der BAC-geklonten Nick-Translation-Methode wird die zu kennzeichnende DNA enzymatisch genickt und dem exponierten 3'-Ende wird ein neues Nukleotid hinzugefügt. Die Aktivität der DNA-Polymerase I fügt ein markiertes Nukleotid hinzu, was zu der gewünschtenSonde 15,16führt. Die verzweigte DNA-Technik beinhaltet Oligonukleotidsonden, die paarweise zu RNA-Zielen hybridisieren, und diese Sonden werden unter Verwendung mehrerer Signalverstärkungsmoleküle amplifiziert. Diese Methode kann das Signal-Rausch-Verhältnis erheblich verbessern, aber die Verstärkung kann die genaue Quantifizierung verzerren, da fluoreszierende Flecken in Größe und Intensität stark unterschiedlich sein können17.
Als Modellsystem für dieses Protokoll, das im Rahmen des NIEHS Superfund Research Program voll eingesetzt wird, um die Auswirkungen endokrin wirksamer Chemikalien in Galveston Bay / Houston Ship Channel zu quantifizieren, verwendeten wir die Östrogenrezeptor (ER) positive Brustkrebszelllinie MCF-7, die über Nacht mit einem ER-Agonisten, 17β-Estradiol (E2)7,18,19behandelt wurde. E2 reguliert viele ER-Target-Gene, darunter das prototypische ER-Target-Gen GREB17,20,21,22. Das hier beschriebene smFISH-Protokoll verwendet einen Satz von zwei spektral getrennten Sondensätzen, die auf GREB1 abzielen; eine, die zu Exons und die andere zu Introns hybridisiert, was die Messung sowohl von reifer als auch von naszierender RNA7ermöglicht. Wir verwenden dann Epifluoreszenzmikroskopie in Verbindung mit Dekonvolution, um smFISH-markierte Proben abbilden, und wenden dann Bildanalyseroutinen an, um die Anzahl der aktiven Allele und reifen RNAs pro Zelle zu quantifizieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:572px;" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">17&#946; Estradiol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E2257</td>
			<td style="width:167px;">CAS Number 50-28-2</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Ambion SSC (20X) Buffer, Rnase-free</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM9770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Corning DMEM with L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MT10017CV</td>
			<td>Manufactured by Invitrogen</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8417</td>
			<td>Without sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dextran Sulfate, 50% Solution Sterile</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">3730-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline Ca++/Mg++</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21030CV</td>
			<td>Manufactured by Calbiochem</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethanol, 200 Proof (100%)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-678-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:119px;">353047</td>
			<td>Manufactured by Decon Laboratories</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS), 500 mL</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-753-2978</td>
			<td>Manufactured by Gemini Bio Products</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">GE Healthcare DeltaVision LIVE High Resolution Deconvolution Microscope</td>
			<td style="width:71px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hyclone Water, Molecular Biology Grade</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SH3053802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Immersion Oil 1.516</td>
			<td style="width:71px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">29162940</td>
			<td>Manufactured by GE Healthcare Bio-Science</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L-glutamine Solution</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MT25005Cl</td>
			<td>Manufactured by Corning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MCF-7 cells</td>
			<td style="width:71px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Molecular Grade Formamide</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">PAH5051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Olympus 60x/1.42 NA Objective</td>
			<td style="width:71px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Parafilm</td>
			<td style="width:71px;">Bemis Company, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">52858-076</td>
			<td>Distributed by VWR</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade</td>
			<td style="width:71px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicilin-Streptomycin Solution</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MT3001Cl</td>
			<td>Manufactured by Corning</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ribonucleoside Vanadyl Complex</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">101229-716</td>
			<td>Manufactured by New England Biosciences</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RNase Away</td>
			<td style="width:71px;">Ambion</td>
			<td align="right" style="width:119px;">9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium pyruvate, 100 mM</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-360-070</td>
			<td>Manufactured by Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thermo Scientific Glass Coverslips, #1.5</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-545-81P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Triton X-100, 100 mL</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP151-100</td>
			<td>Manufactured by Fisher BioReagents</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA Solution 0.25%</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T4049-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectashield Antifade Mounting Medium 10 mL</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC9265087</td>
			<td>Manufactured by Vector Laboratories</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell analysis of transcriptionally active alleles by single molecule fish

Die Gentranskription ist ein wesentlicher Prozess in der Zellbiologie und ermöglicht es Zellen, interne und externe Hinweise zu interpretieren und darauf zu reagieren. Herkömmliche Massenpopulationsmethoden (Northern Blot, PCR und RNAseq), die den mRNA-Spiegel messen, sind nicht in der Lage, Informationen über die Variation der Reaktionen zwischen Zellen zu liefern. Eine präzise Einzelzell- und allelische Visualisierung und Quantifizierung ist über die Einzelmolekül-RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (smFISH) möglich. RNA-FISH wird durch Hybridisierung von Ziel-RNAs mit markierten Oligonukleotidsonden durchgeführt. Diese können in Modalitäten mit mittlerem /hohem Durchsatz abgebildet werden und liefern durch Bildanalyse-Pipelines quantitative Daten sowohl zu ausgereiften als auch zu entstehenden RNAs, alles auf Einzelzellenebene. Die Fixierungs-, Permeabilisierungs-, Hybridisierungs- und Bildgebungsschritte wurden im Labor über viele Jahre mit dem hier beschriebenen Modellsystem optimiert, was zu einer erfolgreichen und robusten Einzelzellanalyse der smFISH-Markierung führt. Das Hauptziel bei der Probenvorbereitung und -verarbeitung ist es, qualitativ hochwertige Bilder zu erzeugen, die sich durch ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis auszeichnen, um Fehlalarme zu reduzieren und genauere Daten bereitzustellen. Hier präsentieren wir ein Protokoll, das die Pipeline von der Probenvorbereitung bis zur Datenanalyse in Verbindung mit Vorschlägen und Optimierungsschritten beschreibt, um sie auf bestimmte Proben zuzuschneiden.

Um hormonelle Reaktionen über smFISH zu analysieren, haben wir beispielsweise das Östrogenrezeptormodell (ER) gewählt, das in Hochdurchsatztests verwendet wird, um das Vorhandensein endokrin wirksamer Chemikalien bei Umweltkatastrophen im Rahmen der Teilnahme am NIEHS Superfund Research Program7zu bestimmen. In diesem Experiment wurden adhärente MCF-7-Brustkrebszellen 24 Stunden lang mit dem ER-Agonisten 17β-Estradiol (E2, 10 nM) oder Vehikel (DMSO) behandelt. Spektral getrennte Sondensätze ...

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Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Die Einzelmolekül-RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (smFISH) ist eine Methode zur genauen Quantifizierung der Konzentrationen und Lokalisierung spezifischer RNAs auf Einzelzellebene. Hier berichten wir über unsere validierten Laborprotokolle für die Nasstischverarbeitung, Bildgebung und Bildanalyse zur Einzelzellquantifizierung spezifischer RNAs.

Einzelzellanalyse transkriptionell aktiver Allele mittels Einzelmolekül FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

single-cell-analysis-transcriptionally-active-alleles-single-molecule

Research

JoVE Journal

Biochemistry

3.1K Aufrufe.  GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics. Die Einzelmolekül-RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (smFISH) ist eine Methode zur genauen Quantifizierung der Konzentrationen und Lokalisierung spezifischer RNAs auf Einzelzellebene. Hier berichten wir über unsere validierten Laborprotokolle für die Nasstischverarbeitung, Bildgebung und Bildanalyse zur Einzelzellquantifizierung spezifischer RNAs.

Serie: Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA processing, and telomere elongation. During these processes, various proteins bind and resolve G4 structures to perform their function. As the function of G4 often depends on the stability of its folded structure, it is important to investigate how G4 binding proteins regulate the stability of G4. This work presents a method to manipulate single G4 molecules using magnetic tweezers, which enables studies of the regulation of G4 binding proteins on a single G4 molecule in real time. In general, this method is suitable for a wide scope of applications in studies for proteins/ligands interactions and regulations on various DNA or RNA secondary structures.

A single-molecule magnetic tweezers platform to manipulate G-quadruplexes is reported, which allows for the study of G4 stability and regulation by various proteins.

Einzelmolekül-Manipulation von G-Quadruplexe von magnetischen Pinzette

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Forschung

Biochemie

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and functions. It gave us the opportunity to explore a multiplicity of biophysical mechanisms, e.g., how bacterial adhesins bind to host surface receptors in more detail. Among other factors, the success of SMFS experiments depends on the functional and native immobilization of the biomolecules of interest on solid surfaces and AFM tips. Here, we describe a straightforward protocol for the covalent coupling of proteins to silicon surfaces using silane-PEG-carboxyls and the well-established N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemistry in order to explore the interaction of pilus-1 adhesin RrgA from the Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) with the extracellular matrix protein fibronectin (Fn). Our results show that the surface functionalization leads to a homogenous distribution of Fn on the glass surface and to an appropriate concentration of RrgA on the AFM cantilever tip, apparent by the target value of up to 20% of interaction events during SMFS measurements and revealed that RrgA binds to Fn with a mean force of 52 pN. The protocol can be adjusted to couple via site specific free thiol groups. This results in a predefined protein or molecule orientation and is suitable for other biophysical applications besides the SMFS.

This protocol describes the covalent immobilization of proteins with a heterobifunctional silane coupling agent to silicon-oxide surfaces designed for the atomic force microscopy based single molecule force spectroscopy which is exemplified by the interaction of RrgA (pilus-1 tip adhesin of S. pneumoniae) with fibronectin.

Kovalente Immobilisierung von Proteinen für die Einzelmolekül-Spektroskopie Kraft

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a fluorescent dye and are spotted by a photodetector following their separation. Single molecule fluorescence imaging can provide ultrasensitive protein detection with its ability for visualizing individual fluorescent molecules. However, the application of this powerful imaging method to electrophoresis assays is hampered by the lack of ways to characterize the homogeneity of fluorescent labeling of each protein species across the proteome. Here, we developed a method to evaluate the labeling homogeneity across the proteome based on a single molecule fluorescence imaging assay. In our measurement using a HeLa cell sample, the proportion of proteins labeled with at least one dye, which we termed &#8216;labeling occupancy&#8217; (LO), was determined to range from 50% to 90%, supporting the high potential of the application of single molecule imaging to sensitive and precise proteome analysis.

Here, we present a protocol to assess the labeling homogeneity for each protein species in a complex protein sample at the single molecule level.

Proteom-weite Quantifizierung des Benennens Homogenität auf der Ebene des einzelnen Moleküls

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve intracellular structures and the dynamics of biomolecules with ~20 nm precision. A prerequisite for SMLM are fluorophores that transition from a dark to a fluorescent state in order to avoid spatio-temporal overlap of their point spread functions in each of the thousands of data acquisition frames. BODIPYs are well-established dyes with numerous conjugates used in conventional microscopy. The transient formation of red-shifted BODIPY ground-state dimers (DII) results in bright single molecule emission enabling single molecule localization microscopy (SMLM). Here we present a simple but versatile protocol for SMLM with conventional BODIPY conjugates in living yeast and mammalian cells. This procedure can be used to acquire super-resolution images and to track single BODIPY-DII states to extract spatio-temporal information of BODIPY conjugates. We apply this procedure to resolve lipid droplets (LDs), fatty acids, and lysosomes in living yeast and mammalian cells at the nanoscopic length scale. Furthermore, we demonstrate the multi-color imaging capability with BODIPY dyes when used in conjunction with other fluorescent&#160;probes. Our representative results show the differential spatial distribution and mobility of BODIPY-fatty acids and neutral lipids in yeast under fed and fasted conditions. This optimized protocol for SMLM can be used with hundreds of commercially available BODIPY conjugates and is a useful resource to study biological processes at the nanoscale far beyond the applications of this work.&#160;

Conventional BODIPY conjugates can be used for live-cell single-molecule localization microscopy (SMLM) through exploitation of their transiently forming, red-shifted ground state dimers. We present an optimized SMLM protocol to track and resolve subcellular neutral lipids and fatty acids in living mammalian and yeast cells at the nanoscopic length scale.

Konventionelle BODIPY-Konjugate für Live-Cell Super-Resolution-Mikroskopie und Single-Molecule Tracking

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed extensive studies of cap-dependent translation and its regulation, high resolution kinetic characterization of this translation pathway is still lacking. Recently, we developed an in vitro assay to measure cap-dependent translation kinetics with single-molecule resolution. The assay is based on fluorescently labeled antibody binding to nascent epitope-tagged polypeptide. By imaging the binding and dissociation of antibodies to and from nascent peptide&#8211;ribosome&#8211;mRNA complexes, the translation progression on individual mRNAs can be tracked. Here, we present a protocol for establishing this assay, including mRNA and PEGylated slide preparations, real-time imaging of translation, and analysis of single molecule trajectories. This assay enables tracking of individual cap-dependent translation events and resolves key translation kinetics, such as initiation and elongation rates. The assay can be widely applied to distinct translation systems and should broadly benefit in vitro studies of cap-dependent translation kinetics and translational control mechanisms.

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Tracking individual translation events allows for high-resolution kinetic studies of cap-dependent translation mechanisms. Here we demonstrate an in vitro single-molecule assay based on imaging interactions between fluorescently labeled antibodies and epitope-tagged nascent peptides. This method enables single-molecule characterization of initiation and peptide elongation kinetics during active in vitro cap-dependent translation.

Ein In Vitro Single-Molecule Imaging Assay zur Analyse von cap-dependent Translation Kinetics

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for hundreds of individual restriction endonuclease (REase) molecules in one experiment. This assay does not require protein labeling and can be carried out with a single imaging channel. In addition, the results of multiple individual experiments can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions. Analysis of the resulting dwell-time distributions can help elucidate the DNA cleavage mechanism by revealing the presence of kinetic steps that cannot be directly observed. Example data collected using this assay with the well-studied REase, EcoRV - a dimeric Type IIP restriction endonuclease that cleaves the palindromic sequence GAT&#8595;ATC (where &#8595; is the cut site) - are in agreement with prior studies. These results suggest that there are at least three steps in the pathway to DNA cleavage that is initiated by introducing magnesium after EcoRV binds DNA in its absence, with an average rate of 0.17 s-1 for each step.

Using quantum-dot-labeled DNA and total internal reflection fluorescence microscopy, we can investigate the reaction mechanism of restriction endonucleases while using unlabeled protein. This single-molecule technique allows for massively multiplexed observation of individual protein-DNA interactions, and data can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions.

Einzelmolekül-Verweilzeitanalyse der Restriktionsendonuklilease-vermittelten DNA-Spaltung

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately 20 nm to accommodate large tRNA substrates at the A-, P- and E-sites. Consequently, the ribosome dynamics are naturally de-phased quickly. Single molecule method can detect each ribosome separately and distinguish inhomogeneous populations, which is essential to reveal the complicated mechanisms of multi-component systems. We report the details of a smFRET method based on the Nikon Ti2 inverted microscope to probe the ribosome dynamics between the ribosomal protein L27 and tRNAs. The L27 is labeled at its unique Cys 53 position and reconstituted into a ribosome that is engineered to lack L27. The tRNA is labeled at its elbow region. As the tRNA moves to different locations inside the ribosome during the elongation cycle, such as pre- and post- translocation, the FRET efficiencies and dynamics exhibit differences, which have suggested multiple subpopulations. These subpopulations are not detectable by ensemble methods. The TIRF-based smFRET microscope is built on a manual or motorized inverted microscope, with home-built laser illumination. The ribosome samples are purified by ultracentrifugation, loaded into a home-built multi-channel sample cell and then illuminated via an evanescent laser field. The reflection laser spot can be used to achieve feedback control of perfect focus. The fluorescence signals are separated by a motorized filter-turret and collected by two digital CMOS cameras. The intensities are retrieved via the NIS-Elements software.

Single molecule fluorescence energy transfer is a method that tracks the tRNA dynamics during ribosomal protein synthesis. By tracking individual ribosomes, inhomogeneous populations are identified, which shed light on mechanisms. This method can be used to track biological conformational changes in general to reveal dynamic-function relationships in many other complexed biosystems. Single molecule methods can observe non-rate limiting steps and low-populated key intermediates, which are not accessible by conventional ensemble methods due to the average effect.

Einzelmolekül-Fluoreszenz-Energieübertragungsstudie zur Ribosomenproteinsynthese

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 (FET) family of fusion oncoproteins, is one of the most frequently involved fusion genes in Ewing sarcoma. These FET family fusion proteins typically harbor a low-complexity domain (LCD) of FET protein at their N-terminus and a DNA-binding domain (DBD) at their C-terminus. EWS-FLI1 has been confirmed to form biomolecular condensates at its target binding loci due to LCD-LCD and LCD-DBD interactions, and these condensates can recruit RNA polymerase II to enhance gene transcription. However, how these condensates are assembled at their binding sites remains unclear. Recently, a single-molecule biophysics method-DNA Curtains-was applied to visualize these assembling processes of EWS-FLI1 condensates. Here, the detailed experimental protocol and data analysis approaches are discussed for the application of DNA Curtains in studying the biomolecular condensates assembling on target DNA.

Here, we describe the use of the single-molecule imaging method, DNA Curtains, to study the biophysical mechanism of EWS-FLI1 condensates assembling on DNA.

Einzelmolekül-Bildgebung von EWS-FLI1-Kondensaten auf DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved single-molecule studies and has gained immense popularity in detecting and understanding the dynamic behavior of fluorescent-tagged molecules. Here, we describe a detailed method for&#160;in vitro single-molecule studies of kinesin-3 family motors using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy. Kinesin-3 is a large family that plays critical roles in cellular and physiological functions ranging from intracellular cargo transport to cell division to development. We have shown previously that constitutively active dimeric kinesin-3 motors exhibit fast and superprocessive motility with high microtubule affinity at the single-molecule level using cell lysates prepared by expressing motor in mammalian cells. Our lab studies kinesin-3 motors and their regulatory mechanisms using cellular, biochemical and biophysical approaches, and such studies demand purified proteins at a large scale. Expression and purification of these motors using mammalian cells would be expensive and time-consuming, whereas expression in a prokaryotic expression system resulted in significantly aggregated and&#160;inactive protein. To overcome the limitations posed by bacterial purification systems and mammalian cell lysate, we have established a robust Sf9-baculovirus expression system to express and purify these motors. The kinesin-3 motors are C-terminally tagged with 3-tandem fluorescent proteins (3xmCitirine or 3xmCit) that provide enhanced signals and decreased photobleaching. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of Sf9 purified proteins demonstrate that kinesin-3 motors are fast and superprocessive akin to our previous studies using mammalian cell lysates. Other applications using these assays include detailed knowledge of oligomer conditions of motors, specific binding partners paralleling biochemical studies, and their kinetic state.

This study details purification of KIF1A(1-393LZ), a member of kinesin-3 family, using Sf9-baculovirus expression system. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of these purified motors exhibited robust motility properties comparable to motors from mammalian cell lysate. Thus, Sf9-baculovirus system is amenable to express and purify motor protein of interest.

Einzelmolekülanalyse von Sf9-gereinigten superprozessiven Motoren der Kinesin-3-Familie

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

<meta charset="utf8"></head><body>In situ Nukleosomenrekonstitution für Einzelmolekülstudien

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding their biophysical properties and interactions with chromatin-binding proteins. Nucleosome reconstitution on DNA for these studies typically involves a salt dialysis procedure that provides precise control over the placement and number of nucleosomes formed along a DNA tether. However, this protocol is time-consuming and requires a substantial amount of DNA and histone octamers as inputs. To offer an alternative strategy, an in situ nucleosome reconstitution method for single-molecule force and fluorescence microscopy that utilizes the histone chaperone Nap1 is described. This method enables users to assemble nucleosomes on any DNA template without the need for strong nucleosome positioning sequences, adjust nucleosome density on demand, and use fewer reagents. In situ nucleosome formation occurs within seconds, offering a simpler experimental workflow and a convenient transition into single-molecule measurements. Examples of two downstream assays for probing nucleosome mechanics and visualizing the behavior of individual proteins on chromatin are further described.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Effiziente Nukleosomenrekonstitution für Einzelmolekültechniken

This article presents a detailed experimental procedure for reconstituting nucleosome-containing DNA tethers for single-molecule correlative force and fluorescence microscopy. It further describes several downstream experiments that can be conducted to visualize the binding behavior of chromatin-interacting proteins and analyze changes in the physical properties of nucleosomes.

In-situ-Nukleosomenassemblierung für die Einzelmolekül-Korrelativkraft- und Fluoreszenzmikroskopie

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding ...