MS2-アフィニティ精製は、細菌に関心のあるRNAの標的を同定するために開発されました。この技術により、あらゆる種類のsRNAパートナーを、規制のメカニズムとは無関係に同定することが可能になります。sRNA依存的な調節ネットワークの特性化は、宿主細胞内の細菌の産生、バイオフィルム形成、生存のより良い毒性因子を理解し、最終的にはブドウ球菌感染と戦うのに役立ちます。
このプロトコルは、任意の病原性または非病原性グラム陽性細菌に適用することができる。この手順のデモンストレーションは、パスカル・ロンビー博士の研究室の博士課程の学生、ノエミー・メルシエです。まず、pCN51 P3 MS2 sRNAまたはpCN51 P3 MS2プラスミドのいずれかを、3ミリリットルのBHI培地で1コロニーずつ増殖させ、1マイクロリットルのエリスロマイシン当たり10マイクログラムを重複して添加する。
エリスロマイシンを添加した新鮮なBHI培地の10ミリリットルで一晩培養を希釈し、0.05のOD 600に達する。180 RPMで6時間揺れで37°Cで文化を育ててください。各培養物を50ミリリットルの遠心分離管に移し、チューブを2,900倍Gで摂氏4度で15分間遠心分離し、上清を捨て、氷を凍らせ、氷の上にペレットを保持し、直接機械的細胞リシスを行います。
機械的な細胞のリシスを行うために、ペレットを5ミリリットルのバッファーAで再懸濁し、リセプドした細胞を3.5グラムのシリカビーズで15ミリリットル遠心分離管に移します。機械的な細胞のライシスの器械に管を挿入し、毎秒4メートルで40秒の周期を実行する。チューブを2,900倍Gで15分間遠心し、上清を回収して氷の上に置きます。
上清がはっきりしていることを確認し、そうでなければ遠心分離を繰り返します。柱の先端を取り出し、カラムラックにクロマトグラフィーカラムを入れ、超純水でカラムを洗います。アミロース樹脂の300マイクロリットルを追加し、バッファA.希薄1、6ミリリットルのバッファAでMBP-MS2タンパク質の200パイカモレでカラムを洗浄し、カラムにロードします。
10ミリリットルのバッファーAでカラムを洗浄し、次にMS2アフィニティ精製を行います。細胞ライセートをカラムにロードし、きれいなコレクションチューブにフロースルー分画を集めます。10ミリリットルのバッファーAでカラムを3回洗い、洗浄分数を収集し、その後、バッファーEの1ミリリットルで列を溶出し、2ミリリットルマイクロチューブに溶出画分を収集します。
RNA抽出まで、収集した分数をすべて氷の上に保管してください。RNA抽出には各分画を1ミリリットル使用してください。RNAに1体積のフェノールを加え、激しく混ぜ、20°Cで10分間Gの16,000倍の遠心分離機を入れます。
上相をきれいな2ミリリットルマイクロチューブに移します。クロロホルム・イソアミルアルコールを1巻ずつ加え、遠心分離を繰り返し、上相を新しいチューブに移します。pH 5.2で2.5容量の100%冷エタノールと酢酸モル3モルナトリウムの0.1容量を加え、マイナス20°Cで一晩沈殿します。
翌日、チューブを16,000倍Gと摂氏4度で15分間遠心分離します。ピペットでエタノールをゆっくりと取り除き、ペレットを乱さないよう注意してください。80%の冷たいエタノールと遠心分離機の500マイクロリットルを5分間加えます。
エタノールをゆっくりとピペットして捨て、実行モードで5分間真空濃縮器を使用してペレットを乾燥させます。ペレットを適量の超純水で再懸濁します。このプロトコルは、S.アウレウスのRsaC標的物を研究するために使用されました。
RsaCと直接相互作用するいくつかのmRNAがMAPS技術を使用して同定され、酸化ストレスおよび金属関連応答における重要な役割を明らかにした。MS2 sRNAの構築物を確認し、その発現パターンを可視化するために、BHI培地で2、4、および6時間の成長後に細胞を採取した。RNAを抽出し、ノーザンブロット分析をRsaC特異的DIGプローブを用いて実施した。
内因性RsaCのレベルは、成長の6時間後に有意に増加した。重要なことに、MS2-RsaC 544およびMS2-RsaC 1,116のレベルは、6時間で内因性RsaCに匹敵した。アフィニティー精製を行い、粗抽出物からRNAを抽出し、MS2タグ単独で発現する野生型株中のフロースルー、溶出画分と、MS2-RsaC 544構築物を発現する変異型RsaC株を抽出した。
1,116ヌクレオチド長い内因性RsaCは溶出画分で濃縮されたが、その長さと複雑な二次構造のためにアフィニティーカラムと非特異的に相互作用した。MS2-RsaC 544は溶出画分で高く富化し、MS2-MBP融合タンパク質によって正常に保持されたことを示しました。生物情報学的分析では、MS2 sRNAとMS2コントロールの間の折り目変化に応じて推定mRNA標的が明らかにされ、sodAが最初の推定標的であることを示した。
MS2アフィニティー精製後にsodA特異的DIGプローブを実施したノーザンブロット分析では、SODAがMS2コントロールと比較してMS2-RsaC 544と効率的に共濃縮されたことが示されています。このプロトコルを試みるとき、MS2タグの追加はsRNAの確認、安定性、または機能に影響を与える可能性があることを覚えておいてください。これは注意深く監視する必要があります。
MAPSは、sRNA-RNAターゲットのペアリングのスナップショットを提供します。さらなる実験的検証は、その機能を解明します。この技術は、任意の細菌にsRNA調節ネットワークを構築するための強力なツールを表します。
