Ms2-аффинная очистка в сочетании с секвенированием РНК или MAPS была разработана для идентификации всего мишеня любой РНК, интересующей бактерии. Эта технология позволяет идентифицировать любой вид партнеров сРНК независимо от механизма регуляции. Характеристика сРНК-зависимых регуляторных сетей поможет лучше понять производство факторов вирулентности, образование биопленки и выживание бактерий в клетках-хозяевах и, в конечном счете, бороться со стафилококковыми инфекциями.
Этот протокол может быть применен к любым патогенным или непатогенным грамположительным бактериям. Продемонстрировать процедуру будет Ноэми Мерсье, аспирант из лаборатории доктора Паскаля Ромби. Для начала вырастите одну колонию штаммов, несущих либо pCN51 P3 MS2 sRNA, либо pCN51 P3 MS2 плазмид в трех миллилитрах среды BHI, дополненных 10 микрограммами на микролитр эритромицина в дубликатах.
Разбавлять каждую культуру на ночь в 50 миллилитрах свежей среды BHI, дополненной эритромицином, до достижения OD 600 0,05. Выращивайте культуры при 37 градусах Цельсия с встряхиванием при 180 оборотах в минуту в течение шести часов. Переложите каждую культуру в 50-миллилитровую центрифужную трубку и центрифугируют трубки в 2 900 раз G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия, затем выбросьте супернатант, заморозьте и храните их при минус 80 градусах Цельсия или держите гранулы на льду и непосредственно выполняйте механический лизис клеток.
Для выполнения механического лизиса клеток повторно суспендируют гранулы в пяти миллилитрах буфера А и переносят повторноуспендированные ячейки в 15-миллилитровые центрифужные трубки с 3,5 граммами кварцевых шариков. Вставьте трубки в механический инструмент лизиса клеток и выполните цикл продолжительностью 40 секунд со скоростью четыре метра в секунду. Центрифугируют трубки в 2, 900 раз G в течение 15 минут, затем извлеките супернатант и удерживайте его на льду.
Убедитесь, что супернатант прозрачен, повторяя центрифугирование, если это не так. Снимите наконечник колонки, затем поместите колонну хроматографии в стойку для колонки и промойте колонку сверхчистой водой. Добавьте 300 микролитров амилозной смолы и промыть колонку 10 миллилитрами буфера А.Разбавить 1, 200 пикамол белка MBP-MS2 в шести миллилитрах буфера А и загрузить его в колонку.
Промыть колонку 10 миллилитрами буфера А.Далее выполнить MS2-аффинную очистку. Загрузите ячейку лисата в колонну и соберите проточная фракция в чистую коллекторную трубку. Промыть колонку три раза 10 миллилитрами буфера А и собрать промывную фракцию, затем элюируют колонну одним миллилитром буфера Е и собирают фракцию элюирования в двухмиллилитровую микротрубку.
Храните все собранные фракции на льду до экстракции РНК. Используйте по одному миллилитру каждой фракции для экстракции РНК. Добавьте один объем фенола в РНК и энергично перемешайте, затем центрифугируют смесь в 16 000 раз g в течение 10 минут при 20 градусах Цельсия.
Переведите верхнюю фазу в чистую двухмиллилитровую микротрубку. Добавьте один объем хлороформного изоамилового спирта и повторите центрифугирование, затем перенесите верхнюю фазу в новую трубку. Добавьте 2,5 объема 100% холодного этанола и 0,1 объема трех молярных ацетатов натрия при рН 5,2 и выпадайте в осадок на ночь при минус 20 градусах Цельсия.
На следующий день центрифугируют трубки в течение 15 минут при 16 000 раз G и четырех градусах Цельсия. Медленно удалите этанол пипеткой, заботясь о том, чтобы не потревожить гранулу. Добавьте 500 микролитров 80% холодного этанола и центрифугу в течение пяти минут.
Выбросьте этанол, медленно пипетируя его, затем высушите гранулу с помощью вакуумного концентратора в течение пяти минут в режиме работы. Повторно суспендировать гранулу в соответствующем объеме сверхчистой воды. Этот протокол был использован для изучения мишеня RsaC в S.aureus.
Несколько мРНК, взаимодействующих непосредственно с RsaC, были идентифицированы с использованием технологии MAPS, что выявило ее решающую роль в окислительном стрессе и реакциях, связанных с металлами. Чтобы подтвердить конструкции сРНК MS2 и визуализировать их паттерн экспрессии, клетки были собраны после двух, четырех и шести часов роста в среде BHI. РНК была извлечена, и анализ Северного пятна был выполнен с использованием RsaC-специфического зонда DIG.
Уровень эндогенного RsaC значительно повысился после шести часов роста. Важно отметить, что уровни MS2-RsaC 544 и MS2-RsaC 1, 116 были сопоставимы с эндогенными RsaC через шесть часов. Проводилась аффинная очистка и РНК извлекались из фракций сырого экстракта, проточной и элюирования в штамме дикого типа, экспрессирующего только метку MS2 и мутантный штамм RsaC, экспрессирующий конструкцию MS2-RsaC 544.
Эндогенный RsaC длиной 1, 116 нуклеотида обогащался фракцией элюирования, но не специфически взаимодействовал с аффинной колонной из-за ее длины и сложной вторичной структуры. MS2-RsaC 544 был высокообогащен фракцией элюирования, демонстрируя, что он успешно удерживается слитым белком MS2-MBP. Биоинформационный анализ выявил мнимые мишени мРНК в соответствии с изменением складки между контролем MS2 sRNA и MS2, что указывает на то, что sodA была первой предполагаемой мишенью.
Анализ Северного пятна, выполненный sodA-специфическим зондом DIG после очистки MS2-аффинности, показывает, что sodA был эффективно обогащен MS2-RsaC 544 по сравнению с контролем MS2. При попытке этого протокола имейте в виду, что добавление тега MS2 может повлиять на подтверждение, стабильность или функцию сРНК. За этим следует тщательно следить.
MAPS обеспечивает снимок сопряжения мишеней сРНК-РНК. Дальнейшая экспериментальная проверка разгадывает их функцию. Этот метод представляет собой мощный инструмент для построения регуляторных сетей сРНК у любых бактерий.
