A purificação de afinidade MS2 aliada ao sequenciamento de RNA ou maps foi desenvolvida para identificar todo o targetome de qualquer RNA de interesse em bactérias. Essa tecnologia permite identificar qualquer tipo de parceiro sRNA independentemente do mecanismo de regulação. A caracterização das redes regulatórias dependentes do SRNA ajudará a entender melhor a produção de fatores de virulência, a formação de biofilme e a sobrevivência das bactérias dentro das células hospedeiras e, finalmente, combater as infecções estafilocócicas.
Este protocolo pode ser aplicado a qualquer bactéria patogênica ou não-patogênica gram-positiva. Demonstrando o procedimento estará Noemie Mercier, uma estudante de doutorado do laboratório do Dr. Pascal Romby. Para começar, crie uma colônia de cepas carregando pCN51 P3 MS2 sRNA ou pCN51 P3 MS2 plasmids em três mililitros de bhi médio suplementado com 10 microgramas por microliter eritromicina em duplicatas.
Diluir cada cultura durante a noite em 50 mililitros de bhi fresco suplementado com eritromicina para atingir um OD 600 de 0,05. Cresça as culturas a 37 graus Celsius com agitação a 180 RPM por seis horas. Transfira cada cultura em um tubo de centrífuga de 50 mililitros e centrífugue os tubos a 2.900 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius, depois descarte o supernasce, congele e armazene-os a menos 80 graus Celsius ou mantenha as pelotas no gelo e realize diretamente a lise celular mecânica.
Para realizar a lise celular mecânica, resuspenda pelotas em cinco mililitros de tampão A e transferir as células resuspended para tubos de centrífugas de 15 mililitros com 3,5 gramas de contas de sílica. Insira os tubos em um instrumento de lise celular mecânica e execute um ciclo de 40 segundos a quatro metros por segundo. Centrifugar os tubos a 2.900 vezes G por 15 minutos, depois recupere o supernasal e mantenha-o no gelo.
Certifique-se de que o supernatante está claro, repetindo a centrifugação se não estiver. Retire a ponta da coluna, depois coloque uma coluna de cromatografia em um rack de coluna e lave a coluna com água ultrapura. Adicione 300 microliters de resina de amilolose e lave a coluna com 10 mililitros de tampão A.Diluir 1,200 picamoles de proteína MBP-MS2 em seis mililitros de tampão A e carregue-a na coluna.
Lave a coluna com 10 mililitros de tampão A.Next, realize a purificação de afinidade MS2. Carregue a célula lysate na coluna e colete a fração de fluxo em um tubo de coleta limpo. Lave a coluna três vezes com 10 mililitros de tampão A e colete a fração de lavagem, em seguida, elute a coluna com um mililitro de buffer E e colete a fração de elução em um microtubo de dois mililitros.
Mantenha todas as frações coletadas no gelo até a extração do RNA. Use um mililitro de cada fração para extração de RNA. Adicione um volume de fenol ao RNA e misture vigorosamente, depois centrifugar a mistura a 16.000 vezes G por 10 minutos a 20 graus Celsius.
Transfira a fase superior para um microtubo de dois mililitros limpos. Adicione um volume de álcool isoamílico de clorofórmio e repita a centrifugação e transfira a fase superior para um novo tubo. Adicione 2,5 volumes de etanol 100% frio e 0,1 volume de três acetato de sódio molar no pH 5.2 e precipitar durante a noite a menos 20 graus Celsius.
No dia seguinte, centrifugar os tubos por 15 minutos a 16.000 vezes G e quatro graus Celsius. Retire lentamente o etanol com uma pipeta, tomando cuidado para não perturbar a pelota. Adicione 500 microliters de 80% de etanol frio e centrífuga por cinco minutos.
Descarte o etanol tubondo-o lentamente e, em seguida, seque a pelota usando um concentrador de vácuo por cinco minutos no modo de execução. Resuspenque a pelota em um volume apropriado de água ultrapura. Este protocolo foi usado para estudar o targetome RsaC em S.aureus.
Vários mRNAs interagindo diretamente com o RsaC foram identificados usando a tecnologia MAPS, revelando seu papel crucial no estresse oxidativo e respostas relacionadas ao metal. Para confirmar as construções de sRNA MS2 e visualizar seu padrão de expressão, as células foram colhidas após duas, quatro e seis horas de crescimento no meio BHI. O RNA foi extraído e a análise da mancha do Norte foi realizada utilizando-se a sonda DIG específica do RsaC.
O nível de RsaC endógeno aumentou significativamente após seis horas de crescimento. É importante ressaltar que o nível de MS2-RsaC 544 e MS2-RsaC 1, 116 eram comparáveis ao RsaC endógeno em seis horas. A purificação de afinidade foi realizada e as RNAs foram extraídas das frações de extrato bruto, fluxo e eluição na cepa do tipo selvagem expressando apenas a tag MS2 e a cepa mutante RsaC expressando a construção MS2-RsaC 544.
O RsaC nucleotídeo de 1.116 nucleotídeos de longa duração foi enriquecido na fração de elução, mas interagiu não especificamente com a coluna de afinidade devido ao seu comprimento e estrutura secundária complexa. O MS2-RsaC 544 foi altamente enriquecido na fração de elução demonstrando que foi retido com sucesso pela proteína de fusão MS2-MBP. Uma análise bioinformática revelou alvos putativos de mRNA de acordo com a mudança de dobra entre o controle ms2 sRNA e MS2, indicando que o sodA foi o primeiro alvo putativo.
Uma análise de manchas do Norte realizada sonda DIG específica do SODA após a purificação de afinidade MS2 mostra que o sodA foi eficientemente co-enriquecido com MS2-RsaC 544 em comparação com o controle MS2. Ao tentar este protocolo, tenha em mente que a adição da tag MS2 pode afetar a confirmação, estabilidade ou função do SRNA. Isso deve ser cuidadosamente monitorado.
O MAPS fornece um instantâneo de emparelhamento de alvos sRNA-RNA. Outra validação experimental irá desvendar sua função. Esta técnica representa uma poderosa ferramenta para construir redes regulatórias sRNA em qualquer bactéria.
