このプロトコルは、鳥類の生殖におけるそれらの生理学的役割のさらなる調査のために鳥の卵から膜膜サブレイヤーをサンプリングするためのステップバイステップの手順を提供します。ペリビテリン膜のサンプリングは、構造および分子の損傷を制限するために各ステップで最適化されています.このプロトコルは、詳細なプロテオミクスのためにさらに開発されました。
生きた未受精卵からペリビテリン層またはPLをサンプリングすることから始めます。卵を割り、卵のセパレーターを使用して卵黄と白身を分離します。小さいはさみでチャラザエを取り出し、フィルターペーパーの上に黄身を転がして、透明だが目に見える構造として現れる付着性アルブミンを取り除きます。
以前に摂氏4度に冷却されたpH 8で10ミリモルトリスHCLを含む結晶化剤に黄身を浸し、鈍いはさみを使用して1センチメートルゾーン内の胚ディスク上のPL領域を取り除きます。緩衝液の中に小さいはさみでPLを破裂させ、その後、破裂したPLの2つの端を鉗子で保持し、黄身を剥がす。卵黄の痕跡が見えないまで、10ミリモルトリスHCLの浴場でPLを数回リンスします。
PL がバッファー内できれいで、白く、浮動していることを確認します。PLを処理してサブレイヤ分離を行うか、生化学的分析に直接進みます。OPLとIPLを分離するには、OPLを上に向けて10ミリモルトリスHCLと50ミリモル塩化ナトリウムで満たされたプラスチックペトリ皿に広げ、できるだけ少ないしわで平らに保つ。
OPLにのみ接続されている残りのチャラザの位置を決定します。その後、PL全体を小さみハサミで約2×3センチメートルに切ります。2つの層を、解剖顕微鏡下で超精密な先端鉗子で機械的に分離します。
得られたIPLおよびOPLサンプルを、さらに使用するまでマイナス80°Cのマイクロチューブに個別に保管してください。一次タンパク質の可溶化を行うために、IPLおよびOPLサンプルを個別に凍結乾燥させて残りの水を除去し、各サンプルから約1ミリグラムを切り取り、漏れ防止スクリューキャップ付きのクリーンマイクロチューブ内に入れます。残りのサンプルを密閉チューブに入れて、長期保存時にマイナス20度またはマイナス80°Cに保ちます。
各凍結乾燥サブ層の1ミリグラムをpH 7と500ミリモル塩化ナトリウムで50ミリモルトリスの400マイクロリットルと混合します。ミキサミルを30ヘルツで5分間2回使用して、構造を微粒子に分解し、タンパク質の可溶化を促進します。サンプル400マイクロリットルを2つのクリーンマイクロチューブに集めます。
電気泳動用のサンプルを準備するには、400マイクロリットルのサンプルに5X SDS-PAGEサンプルバッファーを加え、5分間摂氏100度に加熱します。4~20%のグラディエントSDSポリアクリルアミドゲルの各レーンに最大20マイクログラムのタンパク質をロードし、120ボルトで電気泳動を行います。電気泳動後、ガラス板からゲルを取り出し、クーマシーブリリアントブルー溶液で30分間染色し、50%水、40%エタノール、10%酢酸からなる溶液で脱染色し、ゲルの背景が水色になるまで青く見えます。
脱イオン水を含むペトリ皿にゲルを移し、脱染色と再水和を行います。タンパク質は、透明な背景を持つ青いバンドとして表示される必要があります。PLは、タンパク質損失を最小限に抑え、最適な下層分離を可能にする条件を同定するために様々なバッファーを受けた。
様々なトリス濃度、pH、および塩化ナトリウム濃度で放出されるタンパク質をここに示す。得られた2つのサブ層を解剖顕微鏡下で観察した。IPLは半透明ですが、OPLは緻密で曇りで白っぽいです。
分離後、OPLとIPLは独立して凍結乾燥し、それらのタンパク質含有量は機械的粉砕、アニオン性洗剤、還元剤、および沸騰の組み合わせを使用して完全に溶解した。サンプルはポリアクリルアミドゲルに明確な電気泳動プロファイルを示した。このプロトコルを試みる際には、サブ層の分離は手順の重要なステップであり、塩の最小濃度を含むバッファー内の双眼鏡顕微鏡を使用して行わなければならないことを覚えておいてください。
さらにそれぞれの生理学的機能を解明するために、膜膜サブ層サンプルを電子顕微鏡を用いた組織学的特徴付けや、イメージングアッセイおよび細胞移動を用いた機能研究のために分析することができる。
