K.M.R、S.D.M.、M.U.、D.L.Dはすべてプロメガコーポレーションの従業員です。

1. HiBiT CRISPR標的タンパク質を溶解フォーマットで行い、オプションで細胞生存率蛍光解析を行ったエンドポイント分解試験
<ol><li>哺乳類接着細胞株または懸濁細胞株の調製およびプレーティング<ol><li>継代および細胞増殖に使用される適切な細胞培地で希釈することにより、細胞密度を2.22 x 105/mLに調整します。</li>
		<li>実験条件および対照条件ごとに最低3ウェルのプレートに細胞を分注します。細胞懸濁液のウェルあたり90 μL(20,000細胞)を96ウェルの白いプレートに分注します。384ウェルフォーマットの場合、細胞懸濁液のウェルあたり36 μL(8,000細胞)を384ウェルのホワイトプレートに分注します。</li>
	</ol></li>
	<li>化合物の調製と添加<ol><li>100%DMSO中で最終濃度の1,000倍で段階希釈したPROTACまたはデグレーダーテストコンパウンドプレートを準備します。次に、細胞培養培地で最終濃度の10倍に希釈します。等量のDMSOを培地に添加し、無化合物DMSOコントロールとして使用する。</li>
		<li>96ウェルフォーマットの場合、10 μLの10xコンパウンドおよびコントロール溶液を90 μLの細胞に加えます。384ウェルフォーマットの場合、36 μLの細胞に4 μLの10xコンパウンドおよびコントロール溶液を追加します。</li>
		<li>プレートを37°Cおよび5%CO2 のインキュベーター内で所望の時間またはそれらの成長に最適な条件でインキュベートする。 注:これはエンドポイントアッセイであるため、複数の時点のテストでは、上記のステップ1.1.2で説明したように、各時点ごとに個別の分解プレートを準備する必要があります。化合物媒介分解を検出するためのインキュベーション時間は非常に変動し、化合物濃度にも依存する可能性があります。推奨される初期時点は 6 時間と 24 時間です。</li>
		<li>オプションの細胞生存率測定なしでエンドポイント発光検出を測定する場合は、以下のステップ1.3に直接進んでください。細胞生存率測定でマルチプレックスを行う場合は、以下の次のセクション1.4に進んでください。</li>
	</ol></li>
	<li>細胞の溶解測定<ol><li>HiBiT溶解測定の直前に、溶解バッファー1 mLごとに20 μLの溶解基質と10 μLのLgBiTタンパク質を添加して、2倍の溶解検出試薬を調製します。ピペッティングエラー(すなわち、ウェル数+ 10%)を考慮した追加の容量を含む、アッセイするウェル数に対して十分な2倍の検出試薬を準備します。</li>
		<li>調製した溶解検出試薬を細胞に加える。96ウェルフォーマットの場合、100 μLの細胞を含む各ウェルに100 μLの2x溶解検出試薬を追加します。384ウェルフォーマットの場合、40 μLの細胞を含む各ウェルに40 μLの2x溶解検出試薬を追加します。プレートをマイクロプレートボルテックスミキサーで350rpmで10〜20分間混合します。</li>
		<li>96または384ウェルプレートの発光を読み取ることができるルミネッセンスメーターでルミネセンスを測定します。</li>
	</ol></li>
	<li>オプションの細胞生存率マルチプレックス 注:この手順は、市販のCell力価-蛍光(CTF)キットを使用して実行されます(材料の表を参照)。<ol><li>目的のエンドポイント測定の30〜40分前に、10 μLの基質を2 mLのアッセイバッファーに加えることにより、6x細胞生存率検出試薬溶液を調製します。アッセイする各ウェルに十分な6倍の試薬を準備し、ピペッティングエラーのための余分な容量(すなわち、ウェル数+ 10%)を含めます。</li>
		<li>調製した試薬をウェルに加える。96ウェルフォーマットの場合、すでに100 μLの容量を含む各ウェルに20 μLの6x試薬を追加します。384ウェルフォーマットの場合、40 μLの細胞を含む各ウェルに8 μLの6x試薬を追加します。マイクロプレートボルテックスミキサーで短時間混合した後、37°Cのインキュベーターでプレートを30分間インキュベートします。</li>
		<li>目的の測定エンドポイント(すなわち、処理後6時間または24時間、ステップ1.2.3)で、蛍光を読み取ることができる機器(380-400nmEx/505nmEm)で蛍光を96または384ウェルフォーマットで測定します。</li>
		<li>溶解バッファー1 mLあたり20 μLの溶解基質と10 μLのLgBiTタンパク質を添加して、2x溶解検出試薬を調製します。ピペッティングエラー(ウェル数+10%など)を考慮して、アッセイするウェル数に対して十分な2倍の検出試薬を準備します。</li>
		<li>調製した溶解検出試薬をウェルに加える。96ウェルフォーマットの場合、すでに120 μLの容量を含む各ウェルに120 μLの2x溶解検出試薬を追加します。384ウェルフォーマットの場合、すでに48 μLの容量を含む各ウェルに48 μLの2x溶解検出試薬を追加します。プレートをマイクロプレートボルテックスミキサーで10〜20分間混合します。</li>
		<li>96ウェルまたは384ウェルプレートの発光を読み取ることができるルミネッセンスメーターでルミネセンスを測定します。</li>
	</ol></li>
	<li>分解と細胞生存率の定量化<ol><li>測定された時点でのDMSOコントロールからの相対光単位(RLU)を平均します。この値をターゲットのベースラインタンパク質レベルとして使用して、この同じ時点でテストされた他のすべての処理をこの値に正規化することにより、フラクショナル分解を計算します。たとえば、6時間でのDMSOコントロールウェルの平均RLUが10,000で、6時間での特定の化合物処理のRLUが5,000の場合、分別分解は5,000÷10,000 = 0.5と計算されます(式1)。 式1: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ01.jpg"></li>
		<li>フラクショナルRLUからの劣化率を決定します。 式2: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ02.jpg"></li>
		<li>特定の時点でのフラクショナルRLUまたは%分解をプロットして、化合物の活性をランク付けします。</li>
		<li>オプションで、すべての処理の値をDMSOコントロールと比較することにより、細胞生存率アッセイ測定のための相対蛍光ユニット(RFU)データを分析します。DMSO対照と比較していずれかの処理でRFUの有意な低下が観察された場合、分解データを細胞生存率アッセイデータにさらに正規化して、細胞生存率の損失に対するタンパク質レベルの変化を決定することができます。</li>
	</ol></li>
</ol>2. HiBiT CRISPR標的タンパク質のリアルタイム速度論的分解とオプションの細胞生存率発光アッセイ
注:キネティックスクリーニングおよび分解を行う能力には、細胞内でのLgBiTタンパク質の共発現が必要であり、これは以前に説明されています18、19、63。これは、LgBiTベクターの一過性トランスフェクション、BacMam LgBiTの使用、またはLgBiT安定細胞株へのHiBiT CRISPR挿入を行うことによって達成できます。
<ol><li>接着細胞株のプレーティング。<ol><li>吸引によって細胞フラスコから培地を取り除き、DPBSで細胞を洗浄し、0.05%トリプシン-EDTAで細胞を解離し、細胞をフラスコ底部から解離させます。浮遊細胞株については、セクション2.2に進んでください。</li>
		<li>血清含有細胞培養培地を使用してトリプシンを中和し、混合して細胞を回収して再懸濁し、細胞懸濁液を円錐管に移します。</li>
		<li>セルを125 x g で5分間スピンダウンします。細胞培養培地を廃棄し、等量の新鮮な細胞培養培地に再懸濁します。</li>
		<li>実験条件および対照条件ごとに最低限の三重ウェルでアッセイプレートに細胞をプレート化します。細胞密度を推定するための96ウェルフォーマットカウントでは、アッセイ培地で密度を2 x 105 cells/mLに調整し、96ウェルプレートにウェルあたり100 μL(20,000細胞)を分注します。細胞密度を推定するための384ウェルフォーマットカウントでは、アッセイ培地中の密度を4.44 x 105 細胞/mLに調整し、ウェルあたり18 μL(8,000細胞)を分注します。</li>
		<li>プレートを37°C、5%CO2 で一晩、または成長に最適な条件でインキュベートします。</li>
	</ol></li>
	<li>浮遊セルのめっき<ol><li>10%FBSと1xエンデュラジン(ストック試薬の1:100希釈)を添加したCO 2非依存培地で、細胞密度を2.22 x 105細胞/mLに調整します。</li>
		<li>細胞をアッセイプレートにプレート化し、実験条件および対照条件ごとに最低3ウェルにします。96ウェルフォーマットの場合、ウェルあたり90 μL(20,000細胞)を分注します。384 ウェルフォーマットの場合は、ウェルあたり 36 μL (8,000 セル) を分注します。 注:シグナル対バックグラウンド(S:B)発光が低い懸濁細胞株の場合、例えば、クローンではなくCRISPRプールを使用する場合、播種する細胞数を96ウェルフォーマットで最大100,000細胞/ウェル、384ウェルフォーマットで40,000細胞/ウェルに増やすことで発光を増加させることができます。</li>
	</ol></li>
	<li>LgBiTを発現するHiBiT CRISPR細胞を用いた速度論的分解アッセイ<ol><li>2.2.のめっき工程で含まれていたエンデュラジンを既に含有している懸濁細胞については、直接工程2.3.3に進みます。接着細胞株のために、ナノグロエンデュラジン溶液を調製する。96ウェルフォーマットの場合、ストック試薬を1:100に希釈して、10%FBSを添加したCO2非依存性培地にエンデュラジンの1x溶液を調製します。384ウェルフォーマットの場合、ストック試薬を1:50に希釈して、10%FBSを添加したCO2非依存性培地にエンデュラジンの2x溶液を調製します。</li>
		<li>エンデュラジン溶液を接着細胞の各ウェルに加える。96ウェルフォーマットの吸引培地に対して、90 μLの1xエンデュラジン溶液を加えます。384ウェルフォーマットの場合、18 μLの2xエンデュラジン溶液を18 μLの細胞に加えます。分解アッセイは、384ウェルフォーマットの培養培地とCO2 独立培地の50:50混合物で行われるため、培地を吸引しないでください。</li>
		<li>エンデュラジンを含む懸濁液または接着細胞プレートを37°Cおよび5%CO2 のインキュベーター内で2.5時間インキュベートして、発光を平衡化させます。</li>
		<li>CO2非依存性培地で10倍濃度の試験PROTAC滴定を調製し、96ウェルプレートの各ウェルに10 μL、384ウェルプレートの場合は4 μLを加えます。有効性が不明な化合物の場合、最高点での最終濃度1〜10μMが出発点として推奨されます。</li>
		<li>0〜48時間の間、37°Cに事前平衡化されたルミノメーターで発光の速度論的測定値を収集します。測定の時間増分は実験ごとにカスタマイズできますが、推奨される初期実験は、24時間または希望の時間で5〜15分ごとに発光測定することです。</li>
	</ol></li>
	<li>最終速度論的測定後のオプションの細胞生存率同ウェルマルチプレックス分析 注:このアッセイは、市販のCellTiter-Glo(CTG)キットを使用して実行されます(材料の表を参照)。<ol><li>CTG試薬を室温に平衡化します。</li>
		<li>速度論的分析の最後の時点での分解測定に続いて、プレートのウェルあたり100 μL(96ウェルプレート)または40 μL(384ウェルプレート)の試薬を加え、500〜700 rpmのプレートシェーカー(96ウェルプレート)またはマイクロプレートボルテックスミキサー(384ウェルプレート)で5分間混合します。</li>
		<li>プレートを室温で30分間インキュベートして、細胞溶解とHiBiTシグナルの消光を可能にします。</li>
		<li>ルミノメーターで全発光を測定するには、メーカーの推奨に従ってください。</li>
	</ol></li>
	<li>速度論的劣化プロファイルの定量化<ol><li>収集されたキネティックルミネッセンス測定値を使用して、各PROTAC濃度の生のRLUを、各時点での反復平均DMSO条件に正規化して、時間の経過に伴う遊離フリマジン濃度の変化を説明します。式1を使用して分数RLUを計算します。 式1: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ01.jpg"></li>
		<li>劣化曲線から、式2を使用した単一成分指数減衰モデルを、各曲線の初期劣化部分まで、データがプラトーに達する点まで適合させます。 注:劣化が観察される前に短い遅れがある可能性があるため、最初のいくつかのデータポイントを適合から除外すると便利な場合があります。 式2: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ03.jpg"></li>
		<li>式2から、分解速度定数を表すパラメータƛと、残っているタンパク質の最小量を表すプラトーを決定します。</li>
		<li>分解タンパク質の最大分画量であるDmaxを計算し、1-プラトーとして計算されます。</li>
		<li>PROTACの各濃度についてDmaxをプロットし、時間に依存しない分解効力曲線を決定した。</li>
		<li>2.3.5のプロットの Dmax50 値を決定し、化合物の有効性を分析します。 注意: 特定の時点でDC50を決定するには、選択した時間における各濃度の計算された劣化率をプロットします。これは、DC 50 t=4 h または DC50 t=12 h として指定できます。</li>
	</ol></li>
</ol>

プロメガコーポレーションは、HiBiTおよびNanoLucの技術とアプリケーションの特許を譲渡することにより、商業的所有者です。

ここでは、分解化合物活性をエンドポイント溶解フォーマットまたは生細胞動態モードのいずれかでスクリーニングする2つの方法を紹介します。これらのアプローチは、同じ発光測定原理に基づいていますが、異なるレベルの詳細と理解を提供します。どちらのアプローチを選択するかは、スクリーニングの目標と化合物ライブラリのサイズに依存する可能性があります。検出可能な分解を観察するための大規模な化合物スクリーニングデッキまたは一次スクリーニングの場合、エンドポイント溶解スクリーニングは、ウェスタンブロットや質量分析などの他のエンドポイントアプローチが実用的でないか、適応が難しい場合、高感度で効率的なハイスループット互換性を提供します14。これらのスクリーンの開始点は、限られた数の濃度とタイムポイントで実行できます。試験に推奨される初期濃度は100nM〜10μMの範囲であり、効力が低い、透過性が低い、または場合によっては非常に強力な化合物を含む初期分解剤にはフック効果があることを考慮してください。さらに、4〜6時間での早期発症劣化と18〜24時間での潜在的または持続的な劣化を確立するために、少なくとも2つの異なる時点をテストすることをお勧めします。.高い分解効力とオンターゲットメカニズムを示す化合物は、4〜6時間の時間枠内で容易に観察されますが、後の時点でのみ観察される分解または明らかなタンパク質損失は、さまざまなメカニズムが原因である可能性があります。タンパク質の損失と細胞死による損失を切り離すことができるように、早期および後期の両方の時点で細胞生存率をモニタリングすることを強くお勧めします。あらゆるタイプの発光アッセイまたは蛍光アッセイと同様に、ライブラリー内の化合物がシグナルを妨害または阻害する可能性があるため、無関係の融合またはタンパク質レベルをモニタリングするための代替アプローチを使用したリード化合物との直交フォローアップ実験は、これらのアッセイにおけるRLUの喪失が標的タンパク質分解に直接関連していることを評価するために重要です。
ライブセルキネティックフォーマットで長期間にわたってスクリーニングする能力は、アッセイシグナルからバックグラウンド(S:B)に大きく依存します。 S:Bに寄与する因子には、数桁に及ぶ可能性のある標的タンパク質自体の発現レベル、ペプチド挿入用に選択された細胞株におけるLgBiT発現の効率、 そして、その様々な天然複合体における補完のためのタグ付けされた標的の利用可能性。エンデュラジンまたはビバジンのいずれかを使用したキネティックモードでの分解を正常に測定するために、S:B15で構成される一般的なカットオフ要件を確立しました。S:Bは、エンデュラジンまたはビバジン生細胞基質のいずれかの存在下で、LgBiTのみを発現する未編集の親細胞に対して、LgBiTを共発現するHiBiT編集細胞のベースラインシグナルを測定することによって決定されます。ビバジンはより高い発光シグナルを生成しますが、エンデュラジンよりも速く崩壊し、シグナル取得を24時間以下に制限する可能性があります。さらに、S:Bは、CRISPRプールとクローンのどちらを使用するかに大きく依存することもあります。CRISPR/Cas9エンジニアリングにより適しており、効率が高い細胞株のターゲットの場合、編集された細胞の不均一なCRISPRプール集団は、速度論的分析に十分なS:Bを有する可能性があります。CRISPRを介したゲノム統合の効率が悪いとS:Bが低いプールになる、より困難な細胞株のターゲットの場合、編集された集団を濃縮し、速度論的分析のために十分に高いS:Bを達成するために、CRISPRクローンを単離する必要があるかもしれません。これらのシナリオのいずれかについて、S:Bがエンデュラジンまたはビバジン基質のいずれかで15未満の場合は、エンドポイント溶解スクリーニングが推奨されます。
定量的パラメータによる分解プロファイルの決定を含む化合物のより良い理解と特性評価のために、生細胞でのリアルタイム速度論的分析が推奨されるスクリーニングアプローチです14、18。上記のエンドポイント分析と同様に、初期速度論的スクリーニングは、ハイスループット方式で100nM〜10μMの範囲の限られた濃度数で行うことができます。384ウェルフォーマットでは、100を超える化合物を1つのプレート上で1つの濃度で3回に分けて容易にスクリーニングできます。結果として得られる分解プロファイルは、観察された分解の程度だけでなく、分解速度、分解期間、およびタンパク質の潜在的な回収率に関するガイダンスを提供します14,18(図2および図3)。劣化プロファイルの形状も貴重な情報をもたらします。特異的で強力な分解剤は、数時間で標的タンパク質がプラトーに急速に変化することがよくありますが18,53、転写フィードバックや化合物毒性などの他のメカニズムは、通常、時間の経過とともにタンパク質のより直線的な損失をもたらします。これらの詳細とニュアンスはエンドポイント溶解分析では見落とされており、24〜48時間にわたるリアルタイム分析では、新しい化合物または未知の化合物のセット内で真のDmaxをキャプチャする時間を予測する必要はありません。
リアルタイムキネティクスはまた、化合物の有効性、化合物濃度が初期分解率にどのように影響するかをよりよく理解するための効率的な用量反応スクリーニングを可能にし、複数のパラメータに基づいて化合物をランク付けする可能性を提供します。劣化効力の古典的な測定には、見かけの劣化最大値に基づく特定の時点でのDC50 計算が含まれます。対照的に、効力を評価するための私たちの速度論的アプローチは、それが時間18でいつ起こるかに関係なく、各濃度での真の分解最大値を組み込んでいます。これを速度論的分解能の測定をDmax5018と呼びます。この方法で分析すると、低濃度で分解を開始する可能性があるため、処理後Dmaxに達するまでに時間がかかる化合物が説明されます。分解率とDmaxの両方で化合物をランク付けすることは特に有益です。最も強力な劣化剤の場合、これは低速だが強力な劣化剤を高速で強力な分解剤とさらに区別します。HiBiT CRISPR細胞株を利用した溶解細胞スクリーニングと生細胞動態スクリーニングは、標的タンパク質分解、化合物機能のより包括的な全体像をもたらし、主要な分解パラメータの強化を通じて初期活性評価から下流の化学的最適化までのスクリーニングプロセスを可能にする強力なアプローチです。

標的タンパク質分解は、低分子創薬で最も急速に成長している分野の1つとして浮上しており、癌治療のための免疫調節分子グルー化合物(IMiDなど)の治療の成功、およびキメラ化合物を標的とするタンパク質分解の有望な早期臨床試験データによって大きく支えられています1,2,3,4,5,6,7,8、9,10,11,12。標的タンパク質分解化合物は、E3リガーゼ機械タンパク質1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12を有する標的タンパク質を近接させることによって機能する。.この化合物誘導性のE3リガーゼへの標的タンパク質の動員は、ユビキチンプロテアソーム経路(UPP)を介した標的タンパク質のユビキチン化と分解につながります1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 .歴史的に、低分子創薬スクリーニングプログラムは、活性を評価し、化合物をランク付けするために、初期の生化学的アッセイに依存してきました。しかし、これは、究極の活性であるプロテアソームを介した分解が細胞イベントのカスケードに依存する標的タンパク質分解者にとって重大な課題を提示しています1、2、4、5、6、11、12、13、14、15、16、17、18.ターゲット分解を成功させるために必要なタンパク質複合体の複数の経路と複雑さにより、初期化合物の早期スクリーニングとトリアージのための細胞アッセイアプローチが必要です。現在、細胞環境の状況でハイスループット方式で標的タンパク質の分解を監視する技術の利用可能性は著しく不足しています14。ここでは、分解剤化合物10,11,18,19で処理した後の発光測定を介して標的タンパク質の損失を監視するために、CRISPR/Cas9内因的にタグ付けされたHiBiT標的細胞株18,19,20を使用したリアルタイムの動的生細胞またはエンドポイント溶解分解活性評価のプロトコルを提示します。
治療標的の分解を成功させ、創薬可能なプロテオームを拡大するために、原形質膜、リソソーム、ミトコンドリア膜、細胞質、および核に局在するものを含む、広範囲のタンパク質を破壊対象とすることができる多数のアプローチおよびタイプの分解剤が登場している21–57。最も広く研究されている化合物の2つの主要なクラスは、分子接着剤とタンパク質を標的とするシメラ2、4、5、6、7、12、26です。分子接着剤は一価であるため、通常はサイズが小さく、E3リガーゼ成分2,12,26に結合すると、標的タンパク質との新規タンパク質:タンパク質相互作用界面を促進します。それらは、最も一般的にはセレブロン(CRBN)E3リガーゼ成分2,12,26,55,56,57に結合する分解剤である。最近、DCAF15 58,59,60やDDB145へのCDK/Cyclinリクルートメントなどの他のE3リガーゼ機構を利用したエキサイティングな新しい例は、このクラスの化合物の拡大の可能性を示しています。対照的に、PROTACはより大きく、二価分子であり、標的結合リガンド(ほとんどの場合阻害剤)で構成され、化学リンカーを介してE3リガーゼハンドル1,3,4,5,7,13に架橋されます。そのため、これらの化合物は、E3リガーゼと標的タンパク質1,3,4,5,7,13の両方に直接結合することができる。多数のタンパク質がこれらの二価分子を介して分解されることが示されており、最も使用されているE3リガーゼハンドルは、CRBNまたはフォンヒッペルリンダウ(VHL)のいずれかをリクルートします1,3,4,5,7,13。しかし、タンパク質分解設計を標的とするキメラにおけるE3リガーゼリガーゼリクルートメントに利用可能なハンドルの数は急速に増加しており、このクラスの化合物の能力を拡大し、多様な標的クラスを分解し、細胞または組織タイプの特異性を高める可能性があります24,48,61,62.標的タンパク質と結合するための最小限の要件と組み合わせることで、たとえわずかな親和性であっても、分解化合物は創薬可能なプロテオームの拡大に有望です。
タンパク質喪失の細胞動態、および治療後の潜在的なタンパク質回収を特徴付けることは、分解化合物の機能と有効性を理解するために重要です。ウェスタンブロット抗体アッセイまたは質量分析を使用して、関連する細胞系における内因性タンパク質レベルの変化を研究することは可能ですが、これらのアプローチは、ハイスループットスクリーニングフォーマットに適応することが困難であり、定量能力が限られているか、または多くの時点で速度論的変化を測定する能力があります14。これらの課題に対処するために、我々は、11アミノ酸タグHiBiTのCRISPR/Cas9を介したゲノム挿入を利用する、内因性タンパク質レベルの変化をモニタリングするためのプレートベースの細胞発光システムを開発しました18,19,20。このペプチドは、その結合パートナーであるLgBiTに高い親和性で相補し、その基質の存在下で明るい発光を生成し18,19,20,63、それによってこれらのタグ付き内因性タンパク質を細胞またはライセートで発光させる18,19,20,63.ルミノメーター機器で測定された相対光単位(RRU)は、タグ付けされた標的タンパク質レベル18、19、20、63に正比例します。安定化ルシフェラーゼ基質の開発により、24〜48時間の時間枠にわたるリアルタイムの速度論的タンパク質レベル測定が可能になる18,53,64。これにより、初期分解速度、分解最大(Dmax)、および化合物処理後の回収率の定量分析を含む、任意の所与の化合物濃度における任意の所与の標的に対する完全な分解プロファイルの決定が可能になる18,53。ただし、分解化合物の大規模なライブラリをスクリーニングする場合は、エンドポイント分析をさまざまな薬物濃度と指定された時間で384ウェル形式で簡単に実行することもできます。
この原稿で提示されたプロトコルは、すべてのタイプの分解物に適用可能な、標的タンパク質分解化合物の細胞スクリーニング戦略を表しています。しかしながら、これらのプロトコルと共にHiBiT CRISPR細胞株を使用することは、タンパク質分解に限定されず、化合物の影響または耐性メカニズムを研究するために治療後に調節され得る内因性標的タンパク質レベルをモニタリングするための一般的なツールである20、65、66。これらの発光ベースの検出方法の前提条件は、内因性にタグ付けされたHiBiT標的細胞株であるCRISPRであり、内因性の標的発現とネイティブプロモーター制御を維持しながら、高感度の発光検出を可能にするため重要です18,19,20。ゲノムタグの挿入にCRISRP/Cas9を利用することにおいて、特にスケーラビリティ20および高感度の検出において、CRISPRプールまたはヘテロ接合性またはホモ接合性の対立遺伝子挿入を有するクローンを含む様々なフォーマットで、重要な進歩が見られた18,19,20。内因性タグ付けの代わりに細胞内でHiBiTまたは他のレポーター融合の外因性発現を使用することは可能ですが、タンパク質過剰発現を有する系を用いるには細心の注意を払う必要があります14,18。これらは、標的分解後に活性化される潜在的な転写フィードバックループを含む、真の化合物効力およびタンパク質回収ダイナミクス14,18を理解する上でのアーティファクトにつながる可能性があります。さらに、効力の低い初期段階の化合物は見逃され、スクリーニングで偽陰性として現れる可能性があります。タンパク質の損失は化合物誘発性の毒性および細胞死に起因する可能性があるため、ここに記載されているプロトコルには、強く推奨されていますが、分解プロトコルと組み合わせたオプションの細胞生存率発光または蛍光アッセイが含まれています。プロトコルには、溶解エンドポイントと生細胞動態スクリーニングの2つの主要なセクションがあります。これらの各セクションには、エンドポイントまたはキネティック形式でのマルチプレックス細胞生存率測定のオプションが含まれています。タグ付けされた内因性タンパク質の変化をモニタリングするには、細胞内のLgBiTによる補完が必要です。したがって、キネティックスクリーニングセクションは、一過性または安定な発現を介して達成することができ、生細胞発光測定を実行するために不可欠な、これを導入するための重要なプロトコルを参照します。ここで紹介するすべてのアプローチにより、化合物の迅速なランク順序付けと活性評価が可能になり、初期段階の化合物スクリーニング作業と鉛分解体のより迅速な同定が可能になります。
このプロトコルは、HiBiT CRISPR細胞株と組み合わせた分解化合物の研究用に設計されています。多数の標的に対するHiBiT CRISPR挿入の生成のためのプロトコルは、いくつかの最近の刊行物18、19、20に概説されている。

<table><tbody><tr><td>CellTiter-Glo 2.0 reagent</td><td>Promega</td><td>G9241</td><td>Cell Viability luminescent assay</td></tr><tr><td>CellTiter-Fluor Cell Viability Assay</td><td>Promega</td><td>G6080</td><td>Cell Viability fluorescent assay</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-independent medium</td><td>ThermoFisher</td><td>18045-088</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td>For compound dilution and control</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Seradigm</td><td>89510-194</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>HEK293 LgBiT stable cell line</td><td>Promega</td><td>N2672</td><td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td></tr><tr><td>HiBiT CRISPR mammalian cell line</td><td>Promega</td><td></td><td>&lt;u&gt;https://www.promega.com/crispr-tpd&lt;/u&gt;</td></tr><tr><td>Hygromycin B solution</td><td>Gibco</td><td>10-687-010</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>LgBiT BacMam</td><td>Promega</td><td>CS1956C01</td><td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td></tr><tr><td>LgBiT Expression Vector</td><td>Promega</td><td>N2681</td><td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td></tr><tr><td>Luminometer Plate Reader</td><td></td><td></td><td>Luminomenter capable of measuring luminescence and fluorescence (e.g. GloMax Discover System, Promega GM3000)</td></tr><tr><td>NanoGlo Endurazine live cell substrate</td><td>Promega</td><td>N2570</td><td>Kinetic HiBiT reagent</td></tr><tr><td>NanoGlo Vivazine live cell substrate</td><td>Promega</td><td>N2580</td><td>Kinetic HiBiT reagent</td></tr><tr><td>NanoGlo HiBiT Lytic Detection system</td><td>Promega</td><td>N3030</td><td>Enpoint lytic HiBiT reagent</td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (ThermoFisher)</td><td>ThermoFisher</td><td>11058-021</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Tissue culture plates, white, 96 well plate</td><td>Costar</td><td>3917</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Tissue culture plates, white, 384 well plate</td><td>Corning</td><td>3570</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td>Cell culture</td></tr></tbody></table>

high-throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using hibit crispr cell lines

分子接着剤やタンパク質分解を標的とするキメラを含む標的タンパク質分解化合物は、低分子創薬におけるエキサイティングな新しい治療法です。このクラスの化合物は、ユビキチン-プロテアソーム経路(UPP)を介して標的タンパク質をユビキチン化し、最終的に分解するために必要な標的タンパク質とE3リガーゼ機構タンパク質を近接させることにより、タンパク質分解を誘導します。しかし、ハイスループット方式での標的タンパク質分解のプロファイリングは、分解を達成するために必要な細胞経路の複雑さを考えると、依然として非常に困難です。ここでは、LgBiTタンパク質に高い親和性で補完する11アミノ酸HiBiTタグを持つ標的タンパク質のCRISPR/Cas9内在性タグ付けを使用して発光タンパク質を製造するプロトコルとスクリーニング戦略を提示します。内因性タグを有するこれらのCRISPR標的細胞株は、発光プレートベースのリーダーを使用して発光シグナルをモニタリングすることにより、リアルタイムのキネティックライブセルモードまたはエンドポイント溶解モードのいずれかで化合物誘発分解を測定するために使用できます。ここでは、さまざまなフォーマットで推奨されるスクリーニングプロトコルの概要を説明し、レート、Dmax、DC50、Dmax50の主要な分解パラメータの計算、および細胞生存率アッセイによるマルチプレックスについても説明します。これらのアプローチは、関連する細胞バックグラウンドにおける標的タンパク質の内因性発現と調節を維持しながら、初期段階の化合物の迅速な発見とトリアージを可能にし、リード治療化合物の効率的な最適化を可能にします。

単一濃度エンドポイント溶解分解分析を実証するために、いくつかのCDK標的タンパク質;CDK2、CDK4、CDK7、およびCDK10は、HEK293細胞のC末端にHiBiTで内因的にタグ付けされ、1μM濃度のパンキナーゼセレブロンベースのPROTACTL12-186で処理されました54 (図1A)。CDKタンパク質のレベルを異なる時点で測定し、DMSO対照に対するフラクショナルRLUを決定しました(図1A)。各CDKタンパク質は、化合物処理および様々な時点に応答して異なる程度の分解を示した(図1A)。CDKタンパク質がタンパク質損失に関して互いに直接どのように比較されるかを理解するために、図 1A の分別RLUを総分解%として計算し、 図1Bの各時点についてプロットしました。これは、2時間または4時間の早い時点でさえ、CDKファミリーのメンバーの一部が高レベルの分解を示し、時間の経過とともに上昇傾向にあることを示しています(図1B)。
速度論的分解分析を実証するために、BETファミリーメンバータンパク質のそれぞれ;BRD2、BRD3、およびBRD4は、LgBiTタンパク質18を安定に発現するHEK293細胞のN末端にHiBiTで内在的にタグ付けされました。次に、これらを3つの異なる濃度の汎BETプロタックで処理しました。セレブロンベースのdBET650(図2A)およびVHLベースのARV-77141(図2B)。速度論的測定値は24時間にわたって収集され、各濃度でのプロファイルから、BETファミリーメンバーの応答の違いは容易に明らかです。分解後化合物処理(図2A、B)により迅速な回復応答を開始するBRD2の能力は、他の汎BET PROTACで以前に観察されており、分解プロセスと競合する転写フィードバック応答に起因する可能性が高い18。
エンドポイント分析と速度論的分析の両方は、完全な複合用量反応治療で行うことができます。図3に示されているのは、4つの異なる分子接着剤化合物でLgBiTタンパク質を安定発現するIkaros/IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat細胞の治療の速度論的用量反応分解プロファイルです2,26,55,57;レナリドマイド(図3A)、イベルドマイド(CC-220)(図3B)、サリドマイド(図3C)、およびポマリドマイド(図3D)。これらの分解剤は、化合物間および濃度系列全体で分解応答に大きな違いを示します(図3)。
図3の化合物の分解とランク順序を定量的に評価するために、用量反応プロファイルを使用して、分解率(図4A)、Dmax(図4B)、およびDmax50値(図4B)を含む主要な分解パラメータを計算しました。これらの分析は、イベルドマイド(CC-220)とポマリドマイドが非常に類似した急速な初期分解速度を有することを示していますが(図4A)、イベルドマイド(CC-220)は、直交研究で以前に見られたように最高の効力を持っています55,57(図4B)。イベルドマイドはそのような高い効力を示し、テストされたすべての濃度は50%を超える分解を示すため、イベルドマイドについて得られたDmax50値は、データを正確に適合させる際の制限に基づく推定値を表します。図3C、Dおよび図4Bのグラフから、レナリドマイドもサリドマイドも、試験した最高濃度でIkaros/IKZF1ターゲットを分解しません。サリドマイドで観察された分解がほとんどないため、分解痕跡を指数関数的減衰モデルに正確に適合させることができなかったため、この処理では分解速度を定量化できませんでした。最も強力な分解剤であるイベルドマイド(CC-220)55,57(図4B)。細胞生存率マルチプレックスアッセイは、試験した濃度について細胞生存率の損失を示さなかった(図4C)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig01.jpg"> 図1:パンキナーゼPROTACによるCDKエンドポイントの分解と毒性、TL12-18654。(A)CRISPR/Cas9を介してC末端のHiBiTと融合し、1 μM TL12-186 PROTAC 54で2時間、4時間、8時間、および24 時間処理で分解を評価した内因性CDK標的タンパク質のパネルを選択します。値は、各時点で測定されたDMSOコントロールに対するフラクショナルRLUとして表されます。エラーバーは、3つのテクニカル反復の平均のSDを表します。(B)(A)から算出されたCDK標的タンパク質のパネルの分解率、2、4、8、および24時間の時点で観察された各ファミリーメンバーの分解量を表す。エラーバーは、3つのテクニカル反復の平均のSDを表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig02.jpg"> 図2:BETデグレーダーdBET650 およびARV-77141を用いたBETファミリーメンバーの速度論的分解選択性のプロファイリング。内因性BETファミリーメンバーであるBRD2、BRD3、およびBRD4の速度論的分解プロファイルで、CRISPR/Cas9を介してN末端にHiBiTでタグ付けされ、1 nM(左)、10 nM(中央)、または100 nM(右)dBET650 (A)またはARV-77141 (B)プロタックの単一濃度で処理します。値は、各運動時点でDMSOコントロールから計算されたフラクショナルRLUとして表されます。エラーバーは、4回のテクニカル反復の平均のSDを表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig03.jpg"> 図3:分子接着剤パネルを用いたIkaros/IKZF1-HiBiTの生細胞動態分解線量反応プロファイル2,26,55,57。LgBiTタンパク質を安定に発現するJurkat細胞をCRISPR/Cas9を用いて操作し、Ikaros/IKZF1のC末端にHiBiTペプチドをタグ付けした。細胞を、4つの異なる分子グルー化合物2、26、55、57のDMSOを含む8点用量反応濃度系列で処理した:(A)レナリドマイド、(B)イベルドマイド(CC−220)、(C)サリドマイド、または(D)ポマリドマイド。発光は5分ごとに合計19.5時間測定されました。(A〜D)からの相対光単位(RLU)データは、ステップ2.4.1で説明したようにフラクショナルRLUに変換され、時間の関数としてグラフ化されました。エラーバーは、3つのテクニカル反復のSDを表します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig04.jpg"> 図4:Ikaros/IKZF1-HiBiTの分解率とDmax50の計算、およびマルチプレックス細胞健康アッセイ。 図3の速度論的分解データを使用して、定量的劣化パラメータを計算しました。(A)分解率および(B)分解最大値(Dmax)は、示された分子糊化合物2、26、55、57について各薬物濃度でグラフ化される。(B)各化合物のDmax50値は、ヒルスロープを1に拘束した用量反応モデルを使用して計算され、ターゲットの分解化合物の順序をランク付けするために使用できます。(C)図3Bからのイベルドマイド(CC-220)55,57分解用量応答を用いた細胞生存率アッセイを、速度論的分解測定の完了時にエンドポイント測定として実施した。エラーバーは、3つのテクニカル反復のSDを表します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines

このプロトコルは、標的タンパク質に融合した抗体フリーの内因性タンパク質検出タグを発現させるためにCRISPR/Cas9を使用して操作された生細胞におけるタンパク質分解動態の定量的発光検出について説明しています。定量的劣化パラメータ、レート、Dmax、DC 50、およびDmax50を計算および取得するための詳細な手順が含まれています。

HiBiT CRISPR細胞株を用いた標的タンパク質分解化合物のハイスループット細胞プロファイリング(英語)

Targeted protein degradation compounds, including molecular glues or proteolysis targeting chimeras, are an exciting new therapeutic modality in small ...

high-throughput-cellular-profiling-targeted-protein-degradation

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.3K ビュー.  Promega Corporation. このプロトコルは、標的タンパク質に融合した抗体フリーの内因性タンパク質検出タグを発現させるためにCRISPR/Cas9を使用して操作された生細胞におけるタンパク質分解動態の定量的発光検出について説明しています。定量的劣化パラメータ、レート、Dmax、DC 50、およびDmax50を計算および取得するための詳細な手順が含まれています。

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Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play in the functioning of cells and whole organisms. This cause has been tremendously aided by the recent introduction of the CRISPR/Cas9 system-a versatile tool that allows researchers to manipulate the genome and transcriptome in order to, among other things, knock out, knock down, or knock in genes in a targeted manner. For the purpose of knocking out a gene, CRISPR/Cas9-mediated double-strand breaks recruit the non-homologous end-joining DNA repair pathway to introduce the frameshift-causing insertion or deletion of nucleotides at the break site. However, an individual guide RNA may cause undesirable off-target effects, and to rule these out, the use of multiple guide RNAs is necessary. This multiplicity of targets also means that a high-volume screening of clones is required, which in turn begs the use of an efficient high-throughput technique to genotype the knockout clones. Current genotyping techniques either suffer from inherent limitations or incur high cost, hence rendering them unsuitable for high-throughput purposes. Here, we detail the protocol for using fluorescent PCR, which uses genomic DNA from crude cell lysate as a template, and then resolving the PCR fragments via capillary gel electrophoresis. This technique is accurate enough to differentiate one base-pair difference between fragments and hence is adequate in indicating the presence or absence of a frameshift in the coding sequence of the targeted gene. This precise knowledge effectively precludes the need for a confirmatory sequencing step and allows users to save time and cost in the process. Moreover, this technique has proven to be versatile in genotyping various mammalian cells of various tissue origins targeted by guide RNAs against numerous genes, as shown here and elsewhere.

The genotyping technique described here, which couples fluorescent polymerase chain reaction (PCR) to capillary gel electrophoresis, allows for high-throughput genotyping of nuclease-mediated knockout clones. It circumvents limitations faced by other genotyping techniques and is more cost effective than sequencing methods.

ハイスループットフォーマットでの遺伝子型CRISPR / Cas9媒介ノックアウト変異体に蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法を用いました

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

遺伝学

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide RNA (sgRNA) that confers specificity, the Cas9 protein cleaves both DNA strands at the targeted locus. The DNA break can trigger either non-homologous end joining (NHEJ) or homology directed repair (HDR). NHEJ can introduce small deletions or insertions which lead to frame-shift mutations, while HDR allows for larger and more precise perturbations. Here, we present protocols for generating knockout cell lines by coupling established CRISPR/Cas9 methods with two options for downstream selection/screening. The NHEJ approach uses a single sgRNA cut site and selection-independent screening, where protein production is assessed by dot immunoblot in a high-throughput manner. The HDR approach uses two sgRNA cut sites that span the gene of interest. Together with a provided HDR template, this method can achieve deletion of tens of kb, aided by the inserted selectable resistance marker. The appropriate applications and advantages of each method are discussed.

Recent advances in the ability to genetically manipulate somatic cell lines hold great potential for basic and applied research. Here, we present two approaches for CRISPR/Cas9 generated knockout production and screening in mammalian cell lines, with and without the use of selectable markers.

哺乳類細胞におけるCRISPR / Cas9媒介遺伝子ノックアウトの選択依存性および独立した世代

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene disruption, many of these studies have made use of complex gene knockout models. While these studies with knockout mice offer an elegant and time-tested system for investigating genotype-to-phenotype relationships, a rapid and scalable method for assessing candidate genes that play a role in AML cell proliferation or survival in AML models will help accelerate the parallel interrogation of multiple candidate genes. Recent advances in genome-editing technologies have dramatically enhanced our ability to perform genetic perturbations at an unprecedented scale. One such system of genome editing is the CRISPR-Cas9-based method that can be used to make rapid and efficacious alterations in the target cell genome. The ease and scalability of CRISPR/Cas9-mediated gene-deletion makes it one of the most attractive techniques for the interrogation of a large number of genes in phenotypic assays. Here, we present a simple assay using CRISPR/Cas9 mediated gene-disruption combined with high-throughput flow-cytometry-based competition assays to investigate the role of genes that may play an important role in the proliferation or survival of human and murine AML cell lines.

This manuscript describes a Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) CRISPR-Cas9-based method for simple and expeditious investigation of the role of multiple candidate genes in Acute Myeloid Leukemia (AML) cell proliferation in parallel. This technique is scalable and can be applied in other cancer cell lines as well.

CRISPR ベース Cas9 の競争の試金を使用して遺伝的依存関係の調査

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

がん研究

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian cells, this technology represents a novel means to perform genome-wide genetic screens for functional genomics studies. Libraries of guide RNAs (sgRNA) targeting all open reading frames permit the facile generation of thousands of genetic perturbations in a single pool of cells that can be screened for specific phenotypes to implicate gene function and cellular processes in an unbiased and systematic way. CRISPR-Cas screens provide researchers with a simple, efficient, and inexpensive method to uncover the genetic blueprints for cellular phenotypes. Furthermore, differential analysis of screens performed in various cell lines and from different cancer types can identify genes that are contextually essential in tumor cells, revealing potential targets for specific anticancer therapies. Performing genome-wide screens in human cells can be daunting, as this involves the handling of tens of millions of cells and requires analysis of large sets of data. The details of these screens, such as cell line characterization, CRISPR library considerations, and understanding the limitations and capabilities of CRISPR technology during analysis, are often overlooked. Provided here is a detailed protocol for the successful performance of pooled genome-wide CRISPR-Cas9 based screens.

CRISPR-Cas9 technology provides an efficient method to precisely edit the mammalian genome in any cell type and represents a novel means to perform genome-wide genetic screens. A detailed protocol discussing the steps required for the successful performance of pooled genome-wide CRISPR-Cas9 screens is provided here.

哺乳類細胞におけるCRISPRベースの遺伝子スクリーンのプール

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and functioning of multicellular organisms. Detecting these interactions remains technically challenging, however. This manuscript describes a systematic genome-scale CRISPR/Cas9 knockout genetic screening approach that reveals cellular pathways required for specific cell surface recognition events. This assay utilizes recombinant proteins produced in a mammalian protein expression system as avid binding probes to identify interaction partners in a cell-based genetic screen. This method can be used to identify the genes necessary for cell surface interactions detected by recombinant binding probes corresponding to the ectodomains of membrane-embedded receptors. Importantly, given the genome-scale nature of this approach, it also has the advantage of not only identifying the direct receptor but also the cellular components that are required for the presentation of the receptor at the cell surface, thereby providing valuable insights into the biology of the receptor.

This manuscript describes a genome-scale cell-based screening approach to identify extracellular receptor-ligand interactions.

ゲノムスケールCRISPR/Cas9遺伝子スクリーンを用いた細胞表面受容体同定

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter assays, embryonic stem cell viability assays, and therapeutic drug-based sensitivity assays. Although they have clarified a lot of BRCA1 variants, these assays involving the use of exogenously expressed BRCA1 variants are associated with overexpression issues and cannot be applied to post-transcriptional regulation. To resolve these limitations, we previously reported a method for functional analysis of BRCA1 variants via CRISPR-mediated cytosine base editor that induce targeted nucleotide substitution in living cells. Using this method, we identified variants whose functions remain ambiguous, including c.-97C&#62;T, c.154C&#62;T, c.3847C&#62;T, c.5056C&#62;T, and c.4986+5G&#62;A, and confirmed that CRISPR-mediated base editors are useful tools for reclassifying the variants of uncertain significance in BRCA1. Here, we describe a protocol for functional analysis of BRCA1 variants using CRISPR-based cytosine base editor. This protocol provides guidelines for the selection of target sites, functional analysis and evaluation of BRCA1 variants.

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

People with BRCA1 mutations have a higher risk of developing cancer, which warrants accurate evaluation of the function of BRCA1 variants. Herein, we described a protocol for functional assessment of BRCA1 variants using CRISPR-mediated cytosine base editors that enable targeted C:G to T:A conversion in living cells.

CRISPR媒介ベース・エディタを用いた BRCA1 バリアントの機能評価

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the cell by controlling protein stability, activity, interactions, and intracellular localization. They enable the cell to respond to signals and to adapt to changes in its environment. Alterations within these mechanisms can lead to severe pathological situations such as neurodegenerative diseases and cancers. The aim of the technique described here is to establish ub/ubls dependent PTMs profiles, rapidly and accurately, from cultured cell lines. The comparison of different profiles obtained from different conditions allows the identification of specific alterations, such as those induced by a treatment for example. Lentiviral mediated cell transduction is performed to create stable cell lines expressing a two-tags (6His and Flag) version of the modifier (ubiquitin or a ubl such as SUMO1 or Nedd8). These tags permit the purification of ubiquitin and therefore of ubiquitinated proteins from the cells. This is done through a two-step purification process: The first one is performed in denaturing conditions using the 6His tag, and the second one in native conditions using the Flag tag. This leads to a highly specific and pure isolation of modified proteins which are subsequently identified and semi-quantified by liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technology. Easy informatics analysis of MS data using Excel software enables the establishment of PTM profiles by eliminating background signals. These profiles are compared between each condition in order to identify specific alterations which will then be studied more specifically, starting with their validation by standard biochemistry techniques.

This protocol aims at establishing ubiquitin (Ub) and ubiquitin-likes (Ubls) specific proteomes in order to identify alterations of these kind of post-translational modifications (PTMs), associated with a specific condition such as a treatment or a phenotype.

ユビキチンおよびユビキチン様依存性翻訳後修飾のプロファイリングと有意な変化の同定

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

生化学

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

全細胞集団の単一細胞レベルでサイクリンBの分解を勉強

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

生物学

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with hematological malignancies and are currently being investigated for various solid tumors. CAR-T cells are generated by removing T cells from a patient's blood and engineering them to express a synthetic immune receptor that redirects the T-cells to recognize and eliminate target tumor cells. Gene editing of CAR-T cells has the potential to improve safety of current CAR-T cell therapies and further increase the efficacy of CAR-T cells. Here, we describe methods for the activation, expansion, and characterization of human CRISPR-engineered CD19 directed CAR-T cells. This comprises transduction of the CAR lentiviral vector and use of single guide RNA (sgRNA) and Cas9 endonuclease to target genes of interest in T cells. The methods described in this protocol can be universally applied to other CAR constructs and target genes beyond the ones used for this study. Furthermore, this protocol discusses strategies for gRNA design, lead gRNA selection and target gene knockout validation to reproducibly achieve high-efficiency, multiplex CRISPR-Cas9 engineering of clinical grade human T cells.

Here, we present a protocol for gene editing in primary human T cells using CRISPR Cas Technology to modify CAR-T cells.

ヒトCRISPR設計CAR-T細胞の製造

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with ...

免疫・感染学

Electroporation-Based CRISPR-Cas9-Mediated Gene Knockout in THP-1 Cells and Single-Cell Clone Isolation

The human acute monocytic leukemia (AML) THP-1 cell line is widely used as a model to study the functions of human monocyte-derived macrophages, including their interplay with significant human pathogens such as the human immunodeficiency virus (HIV). Compared to other immortalized cell lines of myeloid origin, THP-1 cells retain many intact inflammatory signaling pathways and display phenotypic characteristics that more closely resemble those of primary monocytes, including the ability to differentiate into macrophages when treated with phorbol-12-myristate 13-acetate (PMA). The use of CRISPR-Cas9 technology to engineer THP-1 cells through targeted gene knockout (KO) provides a powerful approach to better characterize immune-related mechanisms, including virus-host interactions. This article describes a protocol for efficient CRISPR-Cas9-based engineering using electroporation to deliver pre-assembled Cas9:sgRNA ribonucleoproteins into the cell nucleus. Using multiple sgRNAs targeting the same locus at slightly different positions results in the deletion of large DNA fragments, thereby increasing editing efficiency, as assessed by the T7 endonuclease I assay. CRISPR-Cas9-mediated editing at the genetic level was validated by Sanger sequencing followed by Inference of CRISPR Edits (ICE) analysis. Protein depletion was confirmed by immunoblotting coupled with a functional assay. Using this protocol, up to 100% indels in the targeted locus and a decrease of over 95% in protein expression were achieved. The high editing efficiency makes it convenient to isolate single-cell clones by limiting dilution.

The THP-1 cell line is widely used as a model to investigate the functions of human monocytes/macrophages across various biology-related research areas. This article describes a protocol for efficient CRISPR-Cas9-based engineering and single-cell clone isolation, enabling the production of robust and reproducible phenotypic data.

エレクトロポレーションに基づくTHP-1細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子ノックアウトとシングルセルクローン単離

The human acute monocytic leukemia (AML) THP-1 cell line is widely used as a model to study the functions of human monocyte-derived macrophages, including ...