K.M.R、S.D.M.、M.U.、D.L.Dはすべてプロメガコーポレーションの従業員です。

1. HiBiT CRISPR標的タンパク質を溶解フォーマットで行い、オプションで細胞生存率蛍光解析を行ったエンドポイント分解試験
<ol><li>哺乳類接着細胞株または懸濁細胞株の調製およびプレーティング<ol><li>継代および細胞増殖に使用される適切な細胞培地で希釈することにより、細胞密度を2.22 x 105/mLに調整します。</li>
		<li>実験条件および対照条件ごとに最低3ウェルのプレートに細胞を分注します。細胞懸濁液のウェルあたり90 μL(20,000細胞)を96ウェルの白いプレートに分注します。384ウェルフォーマットの場合、細胞懸濁液のウェルあたり36 μL(8,000細胞)を384ウェルのホワイトプレートに分注します。</li>
	</ol></li>
	<li>化合物の調製と添加<ol><li>100%DMSO中で最終濃度の1,000倍で段階希釈したPROTACまたはデグレーダーテストコンパウンドプレートを準備します。次に、細胞培養培地で最終濃度の10倍に希釈します。等量のDMSOを培地に添加し、無化合物DMSOコントロールとして使用する。</li>
		<li>96ウェルフォーマットの場合、10 μLの10xコンパウンドおよびコントロール溶液を90 μLの細胞に加えます。384ウェルフォーマットの場合、36 μLの細胞に4 μLの10xコンパウンドおよびコントロール溶液を追加します。</li>
		<li>プレートを37°Cおよび5%CO2 のインキュベーター内で所望の時間またはそれらの成長に最適な条件でインキュベートする。 注:これはエンドポイントアッセイであるため、複数の時点のテストでは、上記のステップ1.1.2で説明したように、各時点ごとに個別の分解プレートを準備する必要があります。化合物媒介分解を検出するためのインキュベーション時間は非常に変動し、化合物濃度にも依存する可能性があります。推奨される初期時点は 6 時間と 24 時間です。</li>
		<li>オプションの細胞生存率測定なしでエンドポイント発光検出を測定する場合は、以下のステップ1.3に直接進んでください。細胞生存率測定でマルチプレックスを行う場合は、以下の次のセクション1.4に進んでください。</li>
	</ol></li>
	<li>細胞の溶解測定<ol><li>HiBiT溶解測定の直前に、溶解バッファー1 mLごとに20 μLの溶解基質と10 μLのLgBiTタンパク質を添加して、2倍の溶解検出試薬を調製します。ピペッティングエラー(すなわち、ウェル数+ 10%)を考慮した追加の容量を含む、アッセイするウェル数に対して十分な2倍の検出試薬を準備します。</li>
		<li>調製した溶解検出試薬を細胞に加える。96ウェルフォーマットの場合、100 μLの細胞を含む各ウェルに100 μLの2x溶解検出試薬を追加します。384ウェルフォーマットの場合、40 μLの細胞を含む各ウェルに40 μLの2x溶解検出試薬を追加します。プレートをマイクロプレートボルテックスミキサーで350rpmで10〜20分間混合します。</li>
		<li>96または384ウェルプレートの発光を読み取ることができるルミネッセンスメーターでルミネセンスを測定します。</li>
	</ol></li>
	<li>オプションの細胞生存率マルチプレックス 注:この手順は、市販のCell力価-蛍光(CTF)キットを使用して実行されます(材料の表を参照)。<ol><li>目的のエンドポイント測定の30〜40分前に、10 μLの基質を2 mLのアッセイバッファーに加えることにより、6x細胞生存率検出試薬溶液を調製します。アッセイする各ウェルに十分な6倍の試薬を準備し、ピペッティングエラーのための余分な容量(すなわち、ウェル数+ 10%)を含めます。</li>
		<li>調製した試薬をウェルに加える。96ウェルフォーマットの場合、すでに100 μLの容量を含む各ウェルに20 μLの6x試薬を追加します。384ウェルフォーマットの場合、40 μLの細胞を含む各ウェルに8 μLの6x試薬を追加します。マイクロプレートボルテックスミキサーで短時間混合した後、37°Cのインキュベーターでプレートを30分間インキュベートします。</li>
		<li>目的の測定エンドポイント(すなわち、処理後6時間または24時間、ステップ1.2.3)で、蛍光を読み取ることができる機器(380-400nmEx/505nmEm)で蛍光を96または384ウェルフォーマットで測定します。</li>
		<li>溶解バッファー1 mLあたり20 μLの溶解基質と10 μLのLgBiTタンパク質を添加して、2x溶解検出試薬を調製します。ピペッティングエラー(ウェル数+10%など)を考慮して、アッセイするウェル数に対して十分な2倍の検出試薬を準備します。</li>
		<li>調製した溶解検出試薬をウェルに加える。96ウェルフォーマットの場合、すでに120 μLの容量を含む各ウェルに120 μLの2x溶解検出試薬を追加します。384ウェルフォーマットの場合、すでに48 μLの容量を含む各ウェルに48 μLの2x溶解検出試薬を追加します。プレートをマイクロプレートボルテックスミキサーで10〜20分間混合します。</li>
		<li>96ウェルまたは384ウェルプレートの発光を読み取ることができるルミネッセンスメーターでルミネセンスを測定します。</li>
	</ol></li>
	<li>分解と細胞生存率の定量化<ol><li>測定された時点でのDMSOコントロールからの相対光単位(RLU)を平均します。この値をターゲットのベースラインタンパク質レベルとして使用して、この同じ時点でテストされた他のすべての処理をこの値に正規化することにより、フラクショナル分解を計算します。たとえば、6時間でのDMSOコントロールウェルの平均RLUが10,000で、6時間での特定の化合物処理のRLUが5,000の場合、分別分解は5,000÷10,000 = 0.5と計算されます(式1)。 式1: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ01.jpg"></li>
		<li>フラクショナルRLUからの劣化率を決定します。 式2: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ02.jpg"></li>
		<li>特定の時点でのフラクショナルRLUまたは%分解をプロットして、化合物の活性をランク付けします。</li>
		<li>オプションで、すべての処理の値をDMSOコントロールと比較することにより、細胞生存率アッセイ測定のための相対蛍光ユニット(RFU)データを分析します。DMSO対照と比較していずれかの処理でRFUの有意な低下が観察された場合、分解データを細胞生存率アッセイデータにさらに正規化して、細胞生存率の損失に対するタンパク質レベルの変化を決定することができます。</li>
	</ol></li>
</ol>2. HiBiT CRISPR標的タンパク質のリアルタイム速度論的分解とオプションの細胞生存率発光アッセイ
注:キネティックスクリーニングおよび分解を行う能力には、細胞内でのLgBiTタンパク質の共発現が必要であり、これは以前に説明されています18、19、63。これは、LgBiTベクターの一過性トランスフェクション、BacMam LgBiTの使用、またはLgBiT安定細胞株へのHiBiT CRISPR挿入を行うことによって達成できます。
<ol><li>接着細胞株のプレーティング。<ol><li>吸引によって細胞フラスコから培地を取り除き、DPBSで細胞を洗浄し、0.05%トリプシン-EDTAで細胞を解離し、細胞をフラスコ底部から解離させます。浮遊細胞株については、セクション2.2に進んでください。</li>
		<li>血清含有細胞培養培地を使用してトリプシンを中和し、混合して細胞を回収して再懸濁し、細胞懸濁液を円錐管に移します。</li>
		<li>セルを125 x g で5分間スピンダウンします。細胞培養培地を廃棄し、等量の新鮮な細胞培養培地に再懸濁します。</li>
		<li>実験条件および対照条件ごとに最低限の三重ウェルでアッセイプレートに細胞をプレート化します。細胞密度を推定するための96ウェルフォーマットカウントでは、アッセイ培地で密度を2 x 105 cells/mLに調整し、96ウェルプレートにウェルあたり100 μL(20,000細胞)を分注します。細胞密度を推定するための384ウェルフォーマットカウントでは、アッセイ培地中の密度を4.44 x 105 細胞/mLに調整し、ウェルあたり18 μL(8,000細胞)を分注します。</li>
		<li>プレートを37°C、5%CO2 で一晩、または成長に最適な条件でインキュベートします。</li>
	</ol></li>
	<li>浮遊セルのめっき<ol><li>10%FBSと1xエンデュラジン(ストック試薬の1:100希釈)を添加したCO 2非依存培地で、細胞密度を2.22 x 105細胞/mLに調整します。</li>
		<li>細胞をアッセイプレートにプレート化し、実験条件および対照条件ごとに最低3ウェルにします。96ウェルフォーマットの場合、ウェルあたり90 μL(20,000細胞)を分注します。384 ウェルフォーマットの場合は、ウェルあたり 36 μL (8,000 セル) を分注します。 注:シグナル対バックグラウンド(S:B)発光が低い懸濁細胞株の場合、例えば、クローンではなくCRISPRプールを使用する場合、播種する細胞数を96ウェルフォーマットで最大100,000細胞/ウェル、384ウェルフォーマットで40,000細胞/ウェルに増やすことで発光を増加させることができます。</li>
	</ol></li>
	<li>LgBiTを発現するHiBiT CRISPR細胞を用いた速度論的分解アッセイ<ol><li>2.2.のめっき工程で含まれていたエンデュラジンを既に含有している懸濁細胞については、直接工程2.3.3に進みます。接着細胞株のために、ナノグロエンデュラジン溶液を調製する。96ウェルフォーマットの場合、ストック試薬を1:100に希釈して、10%FBSを添加したCO2非依存性培地にエンデュラジンの1x溶液を調製します。384ウェルフォーマットの場合、ストック試薬を1:50に希釈して、10%FBSを添加したCO2非依存性培地にエンデュラジンの2x溶液を調製します。</li>
		<li>エンデュラジン溶液を接着細胞の各ウェルに加える。96ウェルフォーマットの吸引培地に対して、90 μLの1xエンデュラジン溶液を加えます。384ウェルフォーマットの場合、18 μLの2xエンデュラジン溶液を18 μLの細胞に加えます。分解アッセイは、384ウェルフォーマットの培養培地とCO2 独立培地の50:50混合物で行われるため、培地を吸引しないでください。</li>
		<li>エンデュラジンを含む懸濁液または接着細胞プレートを37°Cおよび5%CO2 のインキュベーター内で2.5時間インキュベートして、発光を平衡化させます。</li>
		<li>CO2非依存性培地で10倍濃度の試験PROTAC滴定を調製し、96ウェルプレートの各ウェルに10 μL、384ウェルプレートの場合は4 μLを加えます。有効性が不明な化合物の場合、最高点での最終濃度1〜10μMが出発点として推奨されます。</li>
		<li>0〜48時間の間、37°Cに事前平衡化されたルミノメーターで発光の速度論的測定値を収集します。測定の時間増分は実験ごとにカスタマイズできますが、推奨される初期実験は、24時間または希望の時間で5〜15分ごとに発光測定することです。</li>
	</ol></li>
	<li>最終速度論的測定後のオプションの細胞生存率同ウェルマルチプレックス分析 注:このアッセイは、市販のCellTiter-Glo(CTG)キットを使用して実行されます(材料の表を参照)。<ol><li>CTG試薬を室温に平衡化します。</li>
		<li>速度論的分析の最後の時点での分解測定に続いて、プレートのウェルあたり100 μL(96ウェルプレート)または40 μL(384ウェルプレート)の試薬を加え、500〜700 rpmのプレートシェーカー(96ウェルプレート)またはマイクロプレートボルテックスミキサー(384ウェルプレート)で5分間混合します。</li>
		<li>プレートを室温で30分間インキュベートして、細胞溶解とHiBiTシグナルの消光を可能にします。</li>
		<li>ルミノメーターで全発光を測定するには、メーカーの推奨に従ってください。</li>
	</ol></li>
	<li>速度論的劣化プロファイルの定量化<ol><li>収集されたキネティックルミネッセンス測定値を使用して、各PROTAC濃度の生のRLUを、各時点での反復平均DMSO条件に正規化して、時間の経過に伴う遊離フリマジン濃度の変化を説明します。式1を使用して分数RLUを計算します。 式1: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ01.jpg"></li>
		<li>劣化曲線から、式2を使用した単一成分指数減衰モデルを、各曲線の初期劣化部分まで、データがプラトーに達する点まで適合させます。 注:劣化が観察される前に短い遅れがある可能性があるため、最初のいくつかのデータポイントを適合から除外すると便利な場合があります。 式2: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ03.jpg"></li>
		<li>式2から、分解速度定数を表すパラメータƛと、残っているタンパク質の最小量を表すプラトーを決定します。</li>
		<li>分解タンパク質の最大分画量であるDmaxを計算し、1-プラトーとして計算されます。</li>
		<li>PROTACの各濃度についてDmaxをプロットし、時間に依存しない分解効力曲線を決定した。</li>
		<li>2.3.5のプロットの Dmax50 値を決定し、化合物の有効性を分析します。 注意: 特定の時点でDC50を決定するには、選択した時間における各濃度の計算された劣化率をプロットします。これは、DC 50 t=4 h または DC50 t=12 h として指定できます。</li>
	</ol></li>
</ol>

プロメガコーポレーションは、HiBiTおよびNanoLucの技術とアプリケーションの特許を譲渡することにより、商業的所有者です。

ここでは、分解化合物活性をエンドポイント溶解フォーマットまたは生細胞動態モードのいずれかでスクリーニングする2つの方法を紹介します。これらのアプローチは、同じ発光測定原理に基づいていますが、異なるレベルの詳細と理解を提供します。どちらのアプローチを選択するかは、スクリーニングの目標と化合物ライブラリのサイズに依存する可能性があります。検出可能な分解を観察するための大規模な化合物スクリーニングデッキまたは一次スクリーニングの場合、エンドポイント溶解スクリーニングは、ウェスタンブロットや質量分析などの他のエンドポイントアプローチが実用的でないか、適応が難しい場合、高感度で効率的なハイスループット互換性を提供します14。これらのスクリーンの開始点は、限られた数の濃度とタイムポイントで実行できます。試験に推奨される初期濃度は100nM〜10μMの範囲であり、効力が低い、透過性が低い、または場合によっては非常に強力な化合物を含む初期分解剤にはフック効果があることを考慮してください。さらに、4〜6時間での早期発症劣化と18〜24時間での潜在的または持続的な劣化を確立するために、少なくとも2つの異なる時点をテストすることをお勧めします。.高い分解効力とオンターゲットメカニズムを示す化合物は、4〜6時間の時間枠内で容易に観察されますが、後の時点でのみ観察される分解または明らかなタンパク質損失は、さまざまなメカニズムが原因である可能性があります。タンパク質の損失と細胞死による損失を切り離すことができるように、早期および後期の両方の時点で細胞生存率をモニタリングすることを強くお勧めします。あらゆるタイプの発光アッセイまたは蛍光アッセイと同様に、ライブラリー内の化合物がシグナルを妨害または阻害する可能性があるため、無関係の融合またはタンパク質レベルをモニタリングするための代替アプローチを使用したリード化合物との直交フォローアップ実験は、これらのアッセイにおけるRLUの喪失が標的タンパク質分解に直接関連していることを評価するために重要です。
ライブセルキネティックフォーマットで長期間にわたってスクリーニングする能力は、アッセイシグナルからバックグラウンド(S:B)に大きく依存します。 S:Bに寄与する因子には、数桁に及ぶ可能性のある標的タンパク質自体の発現レベル、ペプチド挿入用に選択された細胞株におけるLgBiT発現の効率、 そして、その様々な天然複合体における補完のためのタグ付けされた標的の利用可能性。エンデュラジンまたはビバジンのいずれかを使用したキネティックモードでの分解を正常に測定するために、S:B15で構成される一般的なカットオフ要件を確立しました。S:Bは、エンデュラジンまたはビバジン生細胞基質のいずれかの存在下で、LgBiTのみを発現する未編集の親細胞に対して、LgBiTを共発現するHiBiT編集細胞のベースラインシグナルを測定することによって決定されます。ビバジンはより高い発光シグナルを生成しますが、エンデュラジンよりも速く崩壊し、シグナル取得を24時間以下に制限する可能性があります。さらに、S:Bは、CRISPRプールとクローンのどちらを使用するかに大きく依存することもあります。CRISPR/Cas9エンジニアリングにより適しており、効率が高い細胞株のターゲットの場合、編集された細胞の不均一なCRISPRプール集団は、速度論的分析に十分なS:Bを有する可能性があります。CRISPRを介したゲノム統合の効率が悪いとS:Bが低いプールになる、より困難な細胞株のターゲットの場合、編集された集団を濃縮し、速度論的分析のために十分に高いS:Bを達成するために、CRISPRクローンを単離する必要があるかもしれません。これらのシナリオのいずれかについて、S:Bがエンデュラジンまたはビバジン基質のいずれかで15未満の場合は、エンドポイント溶解スクリーニングが推奨されます。
定量的パラメータによる分解プロファイルの決定を含む化合物のより良い理解と特性評価のために、生細胞でのリアルタイム速度論的分析が推奨されるスクリーニングアプローチです14、18。上記のエンドポイント分析と同様に、初期速度論的スクリーニングは、ハイスループット方式で100nM〜10μMの範囲の限られた濃度数で行うことができます。384ウェルフォーマットでは、100を超える化合物を1つのプレート上で1つの濃度で3回に分けて容易にスクリーニングできます。結果として得られる分解プロファイルは、観察された分解の程度だけでなく、分解速度、分解期間、およびタンパク質の潜在的な回収率に関するガイダンスを提供します14,18(図2および図3)。劣化プロファイルの形状も貴重な情報をもたらします。特異的で強力な分解剤は、数時間で標的タンパク質がプラトーに急速に変化することがよくありますが18,53、転写フィードバックや化合物毒性などの他のメカニズムは、通常、時間の経過とともにタンパク質のより直線的な損失をもたらします。これらの詳細とニュアンスはエンドポイント溶解分析では見落とされており、24〜48時間にわたるリアルタイム分析では、新しい化合物または未知の化合物のセット内で真のDmaxをキャプチャする時間を予測する必要はありません。
リアルタイムキネティクスはまた、化合物の有効性、化合物濃度が初期分解率にどのように影響するかをよりよく理解するための効率的な用量反応スクリーニングを可能にし、複数のパラメータに基づいて化合物をランク付けする可能性を提供します。劣化効力の古典的な測定には、見かけの劣化最大値に基づく特定の時点でのDC50 計算が含まれます。対照的に、効力を評価するための私たちの速度論的アプローチは、それが時間18でいつ起こるかに関係なく、各濃度での真の分解最大値を組み込んでいます。これを速度論的分解能の測定をDmax5018と呼びます。この方法で分析すると、低濃度で分解を開始する可能性があるため、処理後Dmaxに達するまでに時間がかかる化合物が説明されます。分解率とDmaxの両方で化合物をランク付けすることは特に有益です。最も強力な劣化剤の場合、これは低速だが強力な劣化剤を高速で強力な分解剤とさらに区別します。HiBiT CRISPR細胞株を利用した溶解細胞スクリーニングと生細胞動態スクリーニングは、標的タンパク質分解、化合物機能のより包括的な全体像をもたらし、主要な分解パラメータの強化を通じて初期活性評価から下流の化学的最適化までのスクリーニングプロセスを可能にする強力なアプローチです。

標的タンパク質分解は、低分子創薬で最も急速に成長している分野の1つとして浮上しており、癌治療のための免疫調節分子グルー化合物(IMiDなど)の治療の成功、およびキメラ化合物を標的とするタンパク質分解の有望な早期臨床試験データによって大きく支えられています1,2,3,4,5,6,7,8、9,10,11,12。標的タンパク質分解化合物は、E3リガーゼ機械タンパク質1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12を有する標的タンパク質を近接させることによって機能する。.この化合物誘導性のE3リガーゼへの標的タンパク質の動員は、ユビキチンプロテアソーム経路(UPP)を介した標的タンパク質のユビキチン化と分解につながります1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 .歴史的に、低分子創薬スクリーニングプログラムは、活性を評価し、化合物をランク付けするために、初期の生化学的アッセイに依存してきました。しかし、これは、究極の活性であるプロテアソームを介した分解が細胞イベントのカスケードに依存する標的タンパク質分解者にとって重大な課題を提示しています1、2、4、5、6、11、12、13、14、15、16、17、18.ターゲット分解を成功させるために必要なタンパク質複合体の複数の経路と複雑さにより、初期化合物の早期スクリーニングとトリアージのための細胞アッセイアプローチが必要です。現在、細胞環境の状況でハイスループット方式で標的タンパク質の分解を監視する技術の利用可能性は著しく不足しています14。ここでは、分解剤化合物10,11,18,19で処理した後の発光測定を介して標的タンパク質の損失を監視するために、CRISPR/Cas9内因的にタグ付けされたHiBiT標的細胞株18,19,20を使用したリアルタイムの動的生細胞またはエンドポイント溶解分解活性評価のプロトコルを提示します。
治療標的の分解を成功させ、創薬可能なプロテオームを拡大するために、原形質膜、リソソーム、ミトコンドリア膜、細胞質、および核に局在するものを含む、広範囲のタンパク質を破壊対象とすることができる多数のアプローチおよびタイプの分解剤が登場している21–57。最も広く研究されている化合物の2つの主要なクラスは、分子接着剤とタンパク質を標的とするシメラ2、4、5、6、7、12、26です。分子接着剤は一価であるため、通常はサイズが小さく、E3リガーゼ成分2,12,26に結合すると、標的タンパク質との新規タンパク質:タンパク質相互作用界面を促進します。それらは、最も一般的にはセレブロン(CRBN)E3リガーゼ成分2,12,26,55,56,57に結合する分解剤である。最近、DCAF15 58,59,60やDDB145へのCDK/Cyclinリクルートメントなどの他のE3リガーゼ機構を利用したエキサイティングな新しい例は、このクラスの化合物の拡大の可能性を示しています。対照的に、PROTACはより大きく、二価分子であり、標的結合リガンド(ほとんどの場合阻害剤)で構成され、化学リンカーを介してE3リガーゼハンドル1,3,4,5,7,13に架橋されます。そのため、これらの化合物は、E3リガーゼと標的タンパク質1,3,4,5,7,13の両方に直接結合することができる。多数のタンパク質がこれらの二価分子を介して分解されることが示されており、最も使用されているE3リガーゼハンドルは、CRBNまたはフォンヒッペルリンダウ(VHL)のいずれかをリクルートします1,3,4,5,7,13。しかし、タンパク質分解設計を標的とするキメラにおけるE3リガーゼリガーゼリクルートメントに利用可能なハンドルの数は急速に増加しており、このクラスの化合物の能力を拡大し、多様な標的クラスを分解し、細胞または組織タイプの特異性を高める可能性があります24,48,61,62.標的タンパク質と結合するための最小限の要件と組み合わせることで、たとえわずかな親和性であっても、分解化合物は創薬可能なプロテオームの拡大に有望です。
タンパク質喪失の細胞動態、および治療後の潜在的なタンパク質回収を特徴付けることは、分解化合物の機能と有効性を理解するために重要です。ウェスタンブロット抗体アッセイまたは質量分析を使用して、関連する細胞系における内因性タンパク質レベルの変化を研究することは可能ですが、これらのアプローチは、ハイスループットスクリーニングフォーマットに適応することが困難であり、定量能力が限られているか、または多くの時点で速度論的変化を測定する能力があります14。これらの課題に対処するために、我々は、11アミノ酸タグHiBiTのCRISPR/Cas9を介したゲノム挿入を利用する、内因性タンパク質レベルの変化をモニタリングするためのプレートベースの細胞発光システムを開発しました18,19,20。このペプチドは、その結合パートナーであるLgBiTに高い親和性で相補し、その基質の存在下で明るい発光を生成し18,19,20,63、それによってこれらのタグ付き内因性タンパク質を細胞またはライセートで発光させる18,19,20,63.ルミノメーター機器で測定された相対光単位(RRU)は、タグ付けされた標的タンパク質レベル18、19、20、63に正比例します。安定化ルシフェラーゼ基質の開発により、24〜48時間の時間枠にわたるリアルタイムの速度論的タンパク質レベル測定が可能になる18,53,64。これにより、初期分解速度、分解最大(Dmax)、および化合物処理後の回収率の定量分析を含む、任意の所与の化合物濃度における任意の所与の標的に対する完全な分解プロファイルの決定が可能になる18,53。ただし、分解化合物の大規模なライブラリをスクリーニングする場合は、エンドポイント分析をさまざまな薬物濃度と指定された時間で384ウェル形式で簡単に実行することもできます。
この原稿で提示されたプロトコルは、すべてのタイプの分解物に適用可能な、標的タンパク質分解化合物の細胞スクリーニング戦略を表しています。しかしながら、これらのプロトコルと共にHiBiT CRISPR細胞株を使用することは、タンパク質分解に限定されず、化合物の影響または耐性メカニズムを研究するために治療後に調節され得る内因性標的タンパク質レベルをモニタリングするための一般的なツールである20、65、66。これらの発光ベースの検出方法の前提条件は、内因性にタグ付けされたHiBiT標的細胞株であるCRISPRであり、内因性の標的発現とネイティブプロモーター制御を維持しながら、高感度の発光検出を可能にするため重要です18,19,20。ゲノムタグの挿入にCRISRP/Cas9を利用することにおいて、特にスケーラビリティ20および高感度の検出において、CRISPRプールまたはヘテロ接合性またはホモ接合性の対立遺伝子挿入を有するクローンを含む様々なフォーマットで、重要な進歩が見られた18,19,20。内因性タグ付けの代わりに細胞内でHiBiTまたは他のレポーター融合の外因性発現を使用することは可能ですが、タンパク質過剰発現を有する系を用いるには細心の注意を払う必要があります14,18。これらは、標的分解後に活性化される潜在的な転写フィードバックループを含む、真の化合物効力およびタンパク質回収ダイナミクス14,18を理解する上でのアーティファクトにつながる可能性があります。さらに、効力の低い初期段階の化合物は見逃され、スクリーニングで偽陰性として現れる可能性があります。タンパク質の損失は化合物誘発性の毒性および細胞死に起因する可能性があるため、ここに記載されているプロトコルには、強く推奨されていますが、分解プロトコルと組み合わせたオプションの細胞生存率発光または蛍光アッセイが含まれています。プロトコルには、溶解エンドポイントと生細胞動態スクリーニングの2つの主要なセクションがあります。これらの各セクションには、エンドポイントまたはキネティック形式でのマルチプレックス細胞生存率測定のオプションが含まれています。タグ付けされた内因性タンパク質の変化をモニタリングするには、細胞内のLgBiTによる補完が必要です。したがって、キネティックスクリーニングセクションは、一過性または安定な発現を介して達成することができ、生細胞発光測定を実行するために不可欠な、これを導入するための重要なプロトコルを参照します。ここで紹介するすべてのアプローチにより、化合物の迅速なランク順序付けと活性評価が可能になり、初期段階の化合物スクリーニング作業と鉛分解体のより迅速な同定が可能になります。
このプロトコルは、HiBiT CRISPR細胞株と組み合わせた分解化合物の研究用に設計されています。多数の標的に対するHiBiT CRISPR挿入の生成のためのプロトコルは、いくつかの最近の刊行物18、19、20に概説されている。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 2.0 reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9241</td>
			<td>Cell Viability luminescent assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Fluor Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6080</td>
			<td>Cell Viability fluorescent assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-independent medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18045-088</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>For compound dilution and control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>89510-194</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 LgBiT stable cell line</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2672</td>
			<td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiBiT CRISPR mammalian cell line</td>
			<td>Promega</td>
			<td></td>
			<td>https://www.promega.com/crispr-tpd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-687-010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LgBiT BacMam</td>
			<td>Promega</td>
			<td>CS1956C01</td>
			<td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LgBiT Expression Vector</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2681</td>
			<td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer Plate Reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Luminomenter capable of measuring luminescence and fluorescence (e.g. GloMax Discover System, Promega GM3000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoGlo Endurazine live cell substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2570</td>
			<td>Kinetic HiBiT reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoGlo Vivazine live cell substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2580</td>
			<td>Kinetic HiBiT reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoGlo HiBiT Lytic Detection system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N3030</td>
			<td>Enpoint lytic HiBiT reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (ThermoFisher)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11058-021</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates, white, 96 well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3917</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates, white, 384 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3570</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using hibit crispr cell lines

分子接着剤やタンパク質分解を標的とするキメラを含む標的タンパク質分解化合物は、低分子創薬におけるエキサイティングな新しい治療法です。このクラスの化合物は、ユビキチン-プロテアソーム経路(UPP)を介して標的タンパク質をユビキチン化し、最終的に分解するために必要な標的タンパク質とE3リガーゼ機構タンパク質を近接させることにより、タンパク質分解を誘導します。しかし、ハイスループット方式での標的タンパク質分解のプロファイリングは、分解を達成するために必要な細胞経路の複雑さを考えると、依然として非常に困難です。ここでは、LgBiTタンパク質に高い親和性で補完する11アミノ酸HiBiTタグを持つ標的タンパク質のCRISPR/Cas9内在性タグ付けを使用して発光タンパク質を製造するプロトコルとスクリーニング戦略を提示します。内因性タグを有するこれらのCRISPR標的細胞株は、発光プレートベースのリーダーを使用して発光シグナルをモニタリングすることにより、リアルタイムのキネティックライブセルモードまたはエンドポイント溶解モードのいずれかで化合物誘発分解を測定するために使用できます。ここでは、さまざまなフォーマットで推奨されるスクリーニングプロトコルの概要を説明し、レート、Dmax、DC50、Dmax50の主要な分解パラメータの計算、および細胞生存率アッセイによるマルチプレックスについても説明します。これらのアプローチは、関連する細胞バックグラウンドにおける標的タンパク質の内因性発現と調節を維持しながら、初期段階の化合物の迅速な発見とトリアージを可能にし、リード治療化合物の効率的な最適化を可能にします。

単一濃度エンドポイント溶解分解分析を実証するために、いくつかのCDK標的タンパク質;CDK2、CDK4、CDK7、およびCDK10は、HEK293細胞のC末端にHiBiTで内因的にタグ付けされ、1μM濃度のパンキナーゼセレブロンベースのPROTACTL12-186で処理されました54 (図1A)。CDKタンパク質のレベルを異なる時点で測定し、DMSO対照に対するフラクショナルRLUを決定しました(図1A)。各CDKタンパク質は、化合物処理および様々な時点に応答して異なる程度の分解を示した(図1A)。CDKタンパク質がタンパク質損失に関して互いに直接どのように比較されるかを理解するために、図 1A の分別RLUを総分解%として計算し、 図1Bの各時点についてプロットしました。これは、2時間または4時間の早い時点でさえ、CDKファミリーのメンバーの一部が高レベルの分解を示し、時間の経過とともに上昇傾向にあることを示しています(図1B)。
速度論的分解分析を実証するために、BETファミリーメンバータンパク質のそれぞれ;BRD2、BRD3、およびBRD4は、LgBiTタンパク質18を安定に発現するHEK293細胞のN末端にHiBiTで内在的にタグ付けされました。次に、これらを3つの異なる濃度の汎BETプロタックで処理しました。セレブロンベースのdBET650(図2A)およびVHLベースのARV-77141(図2B)。速度論的測定値は24時間にわたって収集され、各濃度でのプロファイルから、BETファミリーメンバーの応答の違いは容易に明らかです。分解後化合物処理(図2A、B)により迅速な回復応答を開始するBRD2の能力は、他の汎BET PROTACで以前に観察されており、分解プロセスと競合する転写フィードバック応答に起因する可能性が高い18。
エンドポイント分析と速度論的分析の両方は、完全な複合用量反応治療で行うことができます。図3に示されているのは、4つの異なる分子接着剤化合物でLgBiTタンパク質を安定発現するIkaros/IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat細胞の治療の速度論的用量反応分解プロファイルです2,26,55,57;レナリドマイド(図3A)、イベルドマイド(CC-220)(図3B)、サリドマイド(図3C)、およびポマリドマイド(図3D)。これらの分解剤は、化合物間および濃度系列全体で分解応答に大きな違いを示します(図3)。
図3の化合物の分解とランク順序を定量的に評価するために、用量反応プロファイルを使用して、分解率(図4A)、Dmax(図4B)、およびDmax50値(図4B)を含む主要な分解パラメータを計算しました。これらの分析は、イベルドマイド(CC-220)とポマリドマイドが非常に類似した急速な初期分解速度を有することを示していますが(図4A)、イベルドマイド(CC-220)は、直交研究で以前に見られたように最高の効力を持っています55,57(図4B)。イベルドマイドはそのような高い効力を示し、テストされたすべての濃度は50%を超える分解を示すため、イベルドマイドについて得られたDmax50値は、データを正確に適合させる際の制限に基づく推定値を表します。図3C、Dおよび図4Bのグラフから、レナリドマイドもサリドマイドも、試験した最高濃度でIkaros/IKZF1ターゲットを分解しません。サリドマイドで観察された分解がほとんどないため、分解痕跡を指数関数的減衰モデルに正確に適合させることができなかったため、この処理では分解速度を定量化できませんでした。最も強力な分解剤であるイベルドマイド(CC-220)55,57(図4B)。細胞生存率マルチプレックスアッセイは、試験した濃度について細胞生存率の損失を示さなかった(図4C)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig01.jpg"> 図1:パンキナーゼPROTACによるCDKエンドポイントの分解と毒性、TL12-18654。(A)CRISPR/Cas9を介してC末端のHiBiTと融合し、1 μM TL12-186 PROTAC 54で2時間、4時間、8時間、および24 時間処理で分解を評価した内因性CDK標的タンパク質のパネルを選択します。値は、各時点で測定されたDMSOコントロールに対するフラクショナルRLUとして表されます。エラーバーは、3つのテクニカル反復の平均のSDを表します。(B)(A)から算出されたCDK標的タンパク質のパネルの分解率、2、4、8、および24時間の時点で観察された各ファミリーメンバーの分解量を表す。エラーバーは、3つのテクニカル反復の平均のSDを表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig02.jpg"> 図2:BETデグレーダーdBET650 およびARV-77141を用いたBETファミリーメンバーの速度論的分解選択性のプロファイリング。内因性BETファミリーメンバーであるBRD2、BRD3、およびBRD4の速度論的分解プロファイルで、CRISPR/Cas9を介してN末端にHiBiTでタグ付けされ、1 nM(左)、10 nM(中央)、または100 nM(右)dBET650 (A)またはARV-77141 (B)プロタックの単一濃度で処理します。値は、各運動時点でDMSOコントロールから計算されたフラクショナルRLUとして表されます。エラーバーは、4回のテクニカル反復の平均のSDを表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig03.jpg"> 図3:分子接着剤パネルを用いたIkaros/IKZF1-HiBiTの生細胞動態分解線量反応プロファイル2,26,55,57。LgBiTタンパク質を安定に発現するJurkat細胞をCRISPR/Cas9を用いて操作し、Ikaros/IKZF1のC末端にHiBiTペプチドをタグ付けした。細胞を、4つの異なる分子グルー化合物2、26、55、57のDMSOを含む8点用量反応濃度系列で処理した:(A)レナリドマイド、(B)イベルドマイド(CC−220)、(C)サリドマイド、または(D)ポマリドマイド。発光は5分ごとに合計19.5時間測定されました。(A〜D)からの相対光単位(RLU)データは、ステップ2.4.1で説明したようにフラクショナルRLUに変換され、時間の関数としてグラフ化されました。エラーバーは、3つのテクニカル反復のSDを表します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig04.jpg"> 図4:Ikaros/IKZF1-HiBiTの分解率とDmax50の計算、およびマルチプレックス細胞健康アッセイ。 図3の速度論的分解データを使用して、定量的劣化パラメータを計算しました。(A)分解率および(B)分解最大値(Dmax)は、示された分子糊化合物2、26、55、57について各薬物濃度でグラフ化される。(B)各化合物のDmax50値は、ヒルスロープを1に拘束した用量反応モデルを使用して計算され、ターゲットの分解化合物の順序をランク付けするために使用できます。(C)図3Bからのイベルドマイド(CC-220)55,57分解用量応答を用いた細胞生存率アッセイを、速度論的分解測定の完了時にエンドポイント測定として実施した。エラーバーは、3つのテクニカル反復のSDを表します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines

このプロトコルは、標的タンパク質に融合した抗体フリーの内因性タンパク質検出タグを発現させるためにCRISPR/Cas9を使用して操作された生細胞におけるタンパク質分解動態の定量的発光検出について説明しています。定量的劣化パラメータ、レート、Dmax、DC 50、およびDmax50を計算および取得するための詳細な手順が含まれています。

HiBiT CRISPR細胞株を用いた標的タンパク質分解化合物のハイスループット細胞プロファイリング(英語)

Targeted protein degradation compounds, including molecular glues or proteolysis targeting chimeras, are an exciting new therapeutic modality in small ...

high-throughput-cellular-profiling-targeted-protein-degradation

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.1K ビュー.  Promega Corporation. このプロトコルは、標的タンパク質に融合した抗体フリーの内因性タンパク質検出タグを発現させるためにCRISPR/Cas9を使用して操作された生細胞におけるタンパク質分解動態の定量的発光検出について説明しています。定量的劣化パラメータ、レート、Dmax、DC 50、およびDmax50を計算および取得するための詳細な手順が含まれています。

ビデオ: High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move within tissues in a tightly orchestrated manner. During tumor development, this equilibrium is disturbed, and tumor cells leave the epithelium of origin to invade the local microenvironment, to travel to distant sites, and to ultimately form metastatic tumors at distant sites. The dot assay is a simple, two-dimensional unconstrained migration assay, to assess the net movement of cell sheets into a cell-free area, and to analyze parameters of cell migration using time-lapse imaging. Here, the dot assay is demonstrated using a human invasive, lung colony forming breast cancer cell line, MCF10CA1a, to analyze the cells' migratory response to epidermal growth factor (EGF), which is known to increase malignant potential of breast cancer cells and to alter the migratory phenotype of cells.

Cell migration is essential for development, tissue maintenance and repair, and tumorigenesis, and is regulated by growth factors, chemokines, and cytokines. This protocol describes the dot assay, a two-dimensional, unconstrained migration assay to assess the migratory phenotype of attached, cohesive cell sheets in response to microenvironmental cues.

ドットの試金を使用して細胞シートの移行を分析するには

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

がん研究

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide clues to overcoming radioresistance. Voltage-gated calcium channel &#945;2&#948;1 subunit isoform 5 has been reported as a marker for radioresistant CSCs in non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines. Using calcium channel &#945;2&#948;1 subunit as an example of a CSC marker, methods to study the radiosensitivity of CSCs in NSCLC cell lines are presented. CSCs are sorted with putative markers by flow cytometry, and the self-renewal capacity of sorted cells is evaluated by sphere formation assay. Colony formation assay, which determines how many cells lose the ability to generate descendants forming the colony after a certain dose of radiation, is then performed to assess the radiosensitivity of sorted cells. This manuscript provides initial steps for studying the radiosensitivity of CSCs, which establishes the basis for further understanding of the underlying mechanisms.

The presence of cancer stem cells have been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. This manuscript describes the methods to study the radiosensitivity of cancer stem cells in lung cancer cell lines.

肺癌細胞株における癌幹細胞の放射線感受性

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited because very few patient derived SBNET cell lines have been generated. Well-differentiated SBNET cells are slow growing and are hard to propagate. The few cell lines that have been established are not readily available, and after time in culture may not continue to express characteristics of NET cells. Generating new cell lines could take many years since SBNET cells have a long doubling time and many enrichment steps are needed in order to eliminate the rapidly dividing cancer-associated fibroblasts. To overcome these limitations, we have developed a protocol to culture SBNET cells from surgically removed tumors as spheroids in extracellular matrix (ECM). The ECM forms a 3-dimensional matrix that encapsulates SBNET cells and mimics the tumor micro-environment for allowing SBNET cells to grow. Here, we characterized the growth rate of SBNET spheroids and described methods to identify SBNET markers using immunofluorescence microscopy and immunohistochemistry to confirm that the spheroids are neuroendocrine tumor cells. In addition, we used SBNET spheroids for testing the cytotoxicity of rapamycin.

Neuroendocrine tumors (NETs) originate from neuroendocrine cells of the neural crest. They are slow growing and challenging to culture. We present an alternative strategy to grow NETs from the small bowel by culturing them as spheroids. These spheroids have small bowel NET markers and can be used for drug testing.

小腸神経内分泌腫瘍スフェロイドの確立と特徴付け

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great significance for tumor research. Currently, several techniques are used for the identification and purification of CSCs from tumor tissues and tumor cell lines. Separation and analysis of side population (SP) cells are two of the commonly used methods. The methods rely on the ability of CSCs to rapidly expel fluorescent dyes, such as Hoechst 33342. The efflux of the dye is associated with the ATP-binding cassette (ABC) transporters and can be inhibited by ABC transporter inhibitors. Methods for staining cultured tumor cells with Hoechst 33342 and analyzing the proportion of their SP cells by flow cytometry are described. This assay is convenient, fast, and cost-effective. Data generated in this assay can contribute to a better understanding of the effect of genes or other extracellular and intracellular signals on the stemness properties of tumor cells.

A convenient, fast, and cost-effective method to measure the proportion of side population cells in solid tumor cell lines is presented.

固形腫瘍細胞株における側集団の解析

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter assays, embryonic stem cell viability assays, and therapeutic drug-based sensitivity assays. Although they have clarified a lot of BRCA1 variants, these assays involving the use of exogenously expressed BRCA1 variants are associated with overexpression issues and cannot be applied to post-transcriptional regulation. To resolve these limitations, we previously reported a method for functional analysis of BRCA1 variants via CRISPR-mediated cytosine base editor that induce targeted nucleotide substitution in living cells. Using this method, we identified variants whose functions remain ambiguous, including c.-97C&#62;T, c.154C&#62;T, c.3847C&#62;T, c.5056C&#62;T, and c.4986+5G&#62;A, and confirmed that CRISPR-mediated base editors are useful tools for reclassifying the variants of uncertain significance in BRCA1. Here, we describe a protocol for functional analysis of BRCA1 variants using CRISPR-based cytosine base editor. This protocol provides guidelines for the selection of target sites, functional analysis and evaluation of BRCA1 variants.

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

People with BRCA1 mutations have a higher risk of developing cancer, which warrants accurate evaluation of the function of BRCA1 variants. Herein, we described a protocol for functional assessment of BRCA1 variants using CRISPR-mediated cytosine base editors that enable targeted C:G to T:A conversion in living cells.

CRISPR媒介ベース・エディタを用いた BRCA1 バリアントの機能評価

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture models. PDOs have been successfully generated from a variety of human tumors to recapitulate the architecture and function of tumor tissue accurately and efficiently. However, PDOs are unsuitable for an in vitro high-throughput assay system (HTS) or cell analysis using 96-well or 384-well plates when evaluating anticancer drugs because they are heterogeneous in size and form large clusters in culture. These cultures and assays use extracellular matrices, such as Matrigel, to create tumor tissue scaffolds. Therefore, PDOs have a low throughput and high cost, and it has been difficult to develop a suitable assay system. To address this issue, a simpler and more accurate HTS was established using PDOs to evaluate the potency of anticancer drugs and immunotherapy. An in vitro HTS was created that uses PDOs established from solid tumors cultured in 384-well plates. An HTS was also developed for assessment of antibody-dependent cellular cytotoxicity activity to represent the immune response using PDOs cultured in 96-well plates.

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

A highly accurate in vitro high-throughput assay system was developed to evaluate anticancer drugs using patient-derived tumor organoids (PDOs), similar to cancer tissues but are unsuitable for in vitro high-throughput assay systems with 96-well and 384-well plates.

患者由来腫瘍オルガノイドを用いたイン ビトロ アッセイのハイスループット

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and treatment response to targeted inhibitors in cancer. Pioneering work in gastrointestinal and pancreatic cancers has highlighted the promise of patient-derived organoids (PDOs) as a patient-proximate culture system, with an increasing number of models emerging. Similarly, work in other cancer types has focused on establishing organoid models and optimizing culture protocols. Notably, 3D cancer organoid models maintain the genetic complexity of original tumor specimens and thus translate tumor-derived sequencing data into treatment with genetically informed targeted therapies in an experimental setting. Further, PDOs might foster the evaluation of rational combination treatments to overcome resistance-associated adaptation of tumors in the future. The latter focuses on intense research efforts in non-small-cell lung cancer (NSCLC), as resistance development ultimately limits the treatment success of targeted inhibitors. An early assessment of therapeutically targetable mechanisms using NSCLC PDOs could help inform rational combination treatments. This manuscript describes a standardized protocol for the cell culture plate-based assessment of drug sensitivities to targeted inhibitors in NSCLC-derived 3D PDOs, with potential adaptability to combinational treatments and other treatment modalities.

This protocol describes a standardized evaluation of drug sensitivities to targeted signaling inhibitors in NSCLC patient-derived organoid models.

EGFR変異型NSCLC患者由来オルガノイドにおける標的療法に対する感受性のプロファイリング

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing cells as two-dimensional, single-cell monolayers (2D culture), spheroid cell culture promotes, regulates, and supports physiological cellular architecture and characteristics that exist in vivo, including the expression of extracellular matrix proteins, cell signaling, gene expression, protein production, differentiation, and proliferation. The importance of 3D culture has been recognized in many research fields, including oncology, diabetes, stem cell biology, and tissue engineering. Over the last decade, improved methods have been developed to produce spheroids and assess their metabolic function and fate.
Extracellular flux (XF) analyzers have been used to explore mitochondrial function in 3D microtissues such as spheroids using either an XF24 islet capture plate or an XFe96 spheroid microplate. However, distinct protocols and the optimization of probing mitochondrial energy metabolism in spheroids using XF technology have not been described in detail. This paper provides detailed protocols for probing mitochondrial energy metabolism in single 3D spheroids using spheroid microplates with the XFe96 XF analyzer. Using different cancer cell lines, XF technology is demonstrated to be capable of distinguishing between cellular respiration in 3D spheroids of not only different sizes but also different volumes, cell numbers,&#160;DNA content and type.
The optimal mitochondrial effector compound concentrations of oligomycin, BAM15, rotenone, and antimycin A are used to probe specific parameters of mitochondrial energy metabolism in 3D spheroids. This paper also discusses methods to normalize data obtained from spheroids and addresses many considerations that should be considered when exploring spheroid metabolism using XF technology. This protocol will help drive research in advanced in vitro spheroid models.

These protocols will help users probe mitochondrial energy metabolism in 3D cancer cell-line-derived spheroids using Seahorse extracellular flux analysis.

細胞外フラックス解析を用いた単一3D微細組織スフェロイドのミトコンドリアエネルギー代謝の探索

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

懸濁増殖がん細胞からのトランスフォコンドリアサイブリッドの作製

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more efforts are still needed to fully understand the link involving alterations in mitochondria and tumorigenesis, as well as to identify tumor-associated mitochondrial phenotypes. For instance, to evaluate the contribution of mitochondria in tumorigenesis and metastasis processes, it is essential to understand the influence of mitochondria from tumor cells in different nuclear environments. For this purpose, one possible approach consists of transferring mitochondria into a different nuclear background to obtain the so-called cybrid cells. In the traditional cybridization techniques, a cell line lacking mtDNA (&#961;0, nuclear donor cell) is repopulated with mitochondria derived from either enucleated cells or platelets. However, the enucleation process requires good cell adhesion to the culture plate, a feature that is partially or completely lost in many cases in invasive cells. In addition, another difficulty found in the traditional methods is achieving complete removal of the endogenous mtDNA from the mitochondrial-recipient cell line to obtain pure nuclear and mitochondrial DNA backgrounds, avoiding the presence of two different mtDNA species in the generated cybrid. In this work, we present a mitochondrial exchange protocol applied to suspension-growing cancer cells based on the repopulation of rhodamine 6G-pretreated cells with isolated mitochondria. This methodology allows us to overcome the limitations of the traditional approaches, and thus can be used as a tool to expand the comprehension of the mitochondrial role in cancer progression and metastasis.

著者スポットライト:がん細胞株を使用したトランスミトコンドリアサイブリッドの生成  

This protocol describes a technique for cybrid generation from suspension-growing cancer cells as a tool to study the role of mitochondria in the tumorigenic process.

がん細胞株を用いた伝達性サイブリッドの作製

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...