刺激されたラマン散乱顕微鏡は、脂質の迅速かつ定量的な検出を可能にし、生きている動物の脂質をラベルフリーで追跡することを可能にする化学画像技術です。従来の脂質検出技術に対するSRS顕微鏡の最も重要な利点は、ラベルフリーであり、したがって、他の蛍光および染色の問題ほどフォト漂白に持続可能ではないということです。SRS顕微鏡の使用は、モデル生物、特にカエノルハブディティスエレガンスに利用可能な遺伝的および生化学的ツールと組み合わせて使用すると、脂質生物学と代謝の正常な調節因子を研究するための強力なフレームワークを提供します。
レーザービームをSRS顕微鏡に送り込むには、まず、ピコ秒光源出口から顕微鏡のスキャナー上の赤外線レーザー入力ポートにビームを持ち上げ、レーザー制御ソフトウェアを開いてレーザーを開始するようにペリスコープを設定します。ポンプレーザーパワーを50ミリワットに下げ、ポンプ信号を750ナノメートルに設定します。ビームエキスパンダーを使用して、顕微鏡の目的の背面開口に合わせてビーム直径を調整します。
M1とM2の2つのリレーミラーを使用して、レーザービームをペリスコープに導き、ペリスコープのうなずきをチューニング範囲の中心に設定します。レーザービームが鏡の中心に当たって顕微鏡にビームを打ち上げ、顕微鏡の目的砲塔の空のポートを使用してコースアライメントを行うよう、各ミラーの初期位置と角度を選択します。パワーメータープローブを目的ポートに置き、透過光のパワーを測定し、顕微鏡のスキャナーを最高ズーム50倍に設定します。
焦点を合わせレーザビームスポットで伝送光のパワーを測定し、ミラーM1とM2のノブを反復的に最適化して、最高の透過レーザーパワーを達成します。アライメントツールを使用して、透過光の微調整を行い、光が目的の中心を通過していることを確認し、空の目標シートに蛍光ターゲットアライメントキャップを配置します。最初のステアリングミラーM1のノブを調整してレーザービームスポットを中央に配置し、レーザービームスポットを監視するための空の目的シートにもう一方の端にアライメントキャップを持つ延長管を導入します。
次に、2つ目のステアリングミラーM2のノブを調整して、レーザービームスポットを延長管のもう一方の端に再び中央に配置します。SRS検出モジュールを設定するには、コンデンサの後にビームスプリッターキューブを配置し、送信されたレーザーをフォトダイオードモジュールに向けます。エレクトロニクス接続を設定するには、ピコ秒のチューン可能なレーザーの中に20メガヘルツの内蔵電気光学変調器を使用して、ストークスビームの強度を調節し、フォトダイオードの出力信号をロックインアンプに供給して、刺激されたラマン損失を復調させます。
次に、ロックインアンプ出力をマイクロスコープのアナログボックスに送り込み、電気アナログ信号をデジタル信号に変換します。イメージング条件を最適化するには、5マイクロリットルのオレイン酸をミニ顕微鏡スライドチャンバーに加え、カバースリップでサンプルを覆います。サンプルを顕微鏡のステージに置き、パッドの端を使用して液滴を見つけて焦点を当てます。
コーラー照明用のコンデンサを調整し、赤外線センサーカードと赤外線ビューアを使用して、ポンプビームパスがまだ正しいかどうかを確認します。遅延ステージがフェムト秒ゼロに設定されていることを確認し、ポンプビーム波長を795.8ナノメートルに設定します。ポンプビームのパワーを50ミリワットに設定し、ストークビームを100ミリワットに設定します。
両方のビームのシャッターとレーザーのメインシャッターを開きます。サンプルをスキャンし、コンピュータ画面上の画像を確認します。表示モードを高低に変更し、約 50% の彩度を表示するように範囲を調整します。
飽和が画像の中央にあるかどうかを確認し、ピコ秒のチューン可能なレーザーシステム内のステアリングミラーを慎重に調整して、画像強度を最大化し、必要に応じてピーク強度を中央に配置します。各イメージングセッションの前に、100マイクロリットルの暖かい2%アガロースを、2層のラボテープを備えたサポートスライドの間に配置されたきれいなガラススライドに加え、最初のスライドの上に2番目のスライドを素早く配置します。やさしく押して、薄いアガロースパッドを作成し、アガロースを冷却します。
イメージング用のワームを取り付けるには、10~20個のワームにつき4~5マイクロリットルの麻酔薬をカバースリップに置き、解剖顕微鏡を使用して画像化するワームを選び、収集された麻酔の液滴にワームを置きます。すべてのワームが収集されたら、アガロースパッドでガラススライドでワームを覆います。イメージングの場合は、ウォームサンプルをカバースリップで対物レンズに向けて取り付け、明視野光源を接眼レンズに向けて、ワームを見つけます。
ワームに焦点を当て、それに応じてコンデンサーの位置を調整します。ポンプレーザーパワーを200ミリワットに、IRパワーを400ミリワットに設定して、レーザーパワーを調整します。ワームSRS信号の復調用ロックインアンプを設定します。
最初のワームのスキャンを高速スキャン速度で開始し、対象領域を見つけるために細かい焦点を調整します。信号が最適化されたら、SRSイメージを取得するために、より低速なスキャンレートと高いピクセル解像度に切り替え、高解像度の画像を可能にする形式で保存します。すべてのサンプルがイメージ化されたら、レーザー光源をスタンバイ状態にして、関連する機器をすべてオフにします。
画像を解析するには、ImageJ でファイルを開き、解析を選択して、分析するプロパティを選択して測定を設定します。ポリゴン選択ツールを使用して、定量化するワーム腸の領域を概説し、[解析]をクリックしてもう一度測定します。測定結果ウィンドウに測定値が表示されます。
すべてのワームの概要が作成されたら、特定の遺伝子型の各ワームの測定値をコピーしてスプレッドシートに貼り付けます。背景の測定値については、SRS信号を持たないワームの近傍の領域を選択し、個々のワームの測定値から背景平均グレー値を差し引き、所定の遺伝子型または試験群内のすべてのワームから差し引いた背景の平均値と標準偏差を計算します。これらの値は、制御グループの平均に正規化することができます。
この代表的な分析では、成人期にインスリン受容体を欠いた年齢同期性野生型ワームおよびdaf-2変異体における腸内脂質レベルを定量した。予想通り、野生型ワームでは脂質レベルの低下が観察され、1日目から成人期の9日目まで続きます。しかし、daf-2変異体の脂質レベルは、5日後まで増加し、その時点で野生のタイプよりも約2.5〜3倍高いままである。
Daf-16の不活性化は、daf-2変異体の脂質レベルの増加を抑制する。daf-16aaまたはdaf-16bのアイソフォームの発現は、daf-2において、daf-16二重変異体は脂質レベルを回復しない。しかし、daf-16d/f/hアイソフォームの発現は、daf-2、daf-16二重変異体における脂質レベルをdaf-2単一変異体で観察されたレベルに復元するのに十分である。
これらの結果は、daf-16d/f/hアイソフォームがdaf-2変異型ワームにおける脂質代謝を特異的に調節することを示す。イメージングセッション全体を通して、ポンプとストークスのビームに同じレーザーパワーを使用し、6つおよび4つの一貫した定量化ごとに制御グループを含めることが重要です。脂質保存の定量に加えて、SRS顕微鏡検査は重水素などの生体直交タグと結合し、脂質の組み込み、合成および分解のダイナミクスを可視化するために実施することができる。
SRS顕微鏡は多重化を可能にし、異なる細胞下のコンパートメント内の複数の生体分子をイメージするために実施することができる。いわゆるハイパースペクトルSRS顕微鏡は、代謝ダイナミクスを探求する上で大きな未来を持っています。
