La microscopie à diffusion Raman stimulée est une technologie d’imagerie chimique qui permet la détection rapide et quantitative des lipides et permet le suivi des lipides chez les animaux vivants d’une manière sans étiquette. L’avantage le plus important de la microscopie SRS par rapport aux techniques traditionnelles de détection des lipides est qu’elle est sans étiquette et n’est donc pas aussi durable pour le photo blanchiment que d’autres questions de fluorescence et de coloration. L’utilisation de la microscopie SRS en conjonction avec les outils génétiques et biochimiques disponibles pour les organismes modèles, en particulier Caenorhabditis elegans fournit un cadre puissant pour l’étude des régulateurs normaux de la biologie et du métabolisme des lipides.
Pour alimenter les faisceaux laser dans le microscope SRS, tout d’abord, réglez le périscope pour soulever le faisceau d’une sortie de source de lumière picoseconde vers le port d’entrée laser infrarouge sur le scanner du microscope et ouvrez le logiciel de contrôle laser pour démarrer les lasers. Abaissez la puissance laser de la pompe à 50 milliwatts et réglez le signal de la pompe à 750 nanomètres. Utilisez un expanseur de faisceau pour ajuster le diamètre du faisceau afin de l’adapter à l’ouverture arrière des objectifs du microscope.
Utilisez deux miroirs relais, M1 et M2, pour guider le faisceau laser vers le périscope et régler les hochements de la main du périscope au centre de la plage d’accord. Sélectionnez la position initiale et l’angle de chaque miroir de sorte que le faisceau laser frappe approximativement le centre du miroir pour lancer le faisceau dans le microscope et utiliser un port vide sur la tourelle objective du microscope pour effectuer l’alignement de la trajectoire. Placez la sonde du capteur de puissance à l’orifice de l’objectif pour mesurer la puissance de la lumière transmise et réglez le scanner du microscope au zoom le plus élevé, 50X.
Mesurez la puissance de la lumière transmise avec le point de faisceau laser focalisé et optimisez les boutons des miroirs M1 et M2 de manière itérative pour atteindre la puissance laser transmise la plus élevée. Utilisez l’outil d’alignement pour effectuer l’alignement fin de la lumière transmise afin de vous assurer que la lumière passe par le centre de l’objectif et placez le capuchon d’alignement de la cible de fluorescence sur le siège de l’objectif vide. Ajustez les boutons du premier rétroviseur de direction, M1, pour centrer le point de faisceau laser et introduisez le tube d’extension avec le capuchon d’alignement à l’autre extrémité à un siège d’objectif vide pour surveiller le point de faisceau laser.
Ensuite, réglez les boutons du deuxième rétroviseur de direction, M2, pour centrer à nouveau le point de faisceau laser à l’autre extrémité du tube d’extension. Pour configurer le module de détection SRS, placez un cube séparateur de faisceau après le condenseur pour diriger le laser transmis vers le module de photo diode. Pour configurer la connexion électronique, utilisez un modulateur électro-optique intégré à 20 mégahertz à l’intérieur du laser accordable picoseconde pour moduler l’intensité du faisceau de Stokes et alimenter le signal de sortie de la photo diode dans l’amplificateur de verrouillage pour la démodulation de la perte Raman stimulée.
Ensuite, alimentez la sortie de l’amplificateur verrouillé dans la boîte analogique du microscope pour convertir le signal analogique électrique en signal numérique. Pour optimiser les conditions d’imagerie, ajoutez cinq microlitres d’acide oléique à une mini chambre à lame du microscope et couvrez l’échantillon avec un glissement de couverture. Placez l’échantillon sur l’étage du microscope et utilisez le bord du tampon pour localiser et concentrer sur la gouttelette.
Ajustez le condenseur pour l’éclairage Kohler et utilisez une carte de capteur infrarouge et une visionneuse infrarouge pour vérifier si le chemin du faisceau de la pompe est toujours correct. Vérifiez que l’étage de retard est réglé sur zéro femtosecondes et réglez la longueur d’onde du faisceau de la pompe à 795,8 nanomètres. Réglez la puissance du faisceau de la pompe à 50 milliwatts et réglez le faisceau Stoke à 100 milliwatts.
Ouvrez l’obturateur pour les deux faisceaux, ainsi que l’obturateur principal du laser. Numérisez l’échantillon et vérifiez l’image sur l’écran de l’ordinateur. Changez le mode d’affichage à haut bas et ajustez la plage pour voir une saturation d’environ 50%.
Vérifiez si la saturation est centrée dans l’image, en ajustant soigneusement les rétroviseurs de direction à l’intérieur du système laser réglable picoseconde pour un chevauchement optimisé de la pompe et des Stokes afin de maximiser l’intensité de l’image et de centrer l’intensité maximale si nécessaire. Avant chaque séance d’imagerie, ajoutez 100 microlitres d’agarose chaude à 2 % à une lame de verre propre placée entre des lames de soutien avec deux couches de ruban de laboratoire et placez rapidement une deuxième lame sur la première lame. Pressé doucement pour créer un tampon d’agarose mince et uniforme et laisser l’agarose refroidir.
Pour monter les vers pour l’imagerie, placez une goutte de quatre à cinq microlitres d’agent anesthésique par 10 à 20 vers sur un glissement de couverture et utilisez un microscope de dissection pour choisir les vers à imager, en plaçant les vers sur la gouttelette de l’anesthésie au fur et à mesure qu’ils sont collectés. Lorsque tous les vers ont été collectés, couvrez-les avec la lame de verre avec le tampon d’agarose. Pour l’imagerie, montez l’échantillon de ver avec le glissement du couvercle face à la lentille de l’objectif et dirigez la source de lumière à champ lumineux vers l’oculaire pour localiser les vers.
Ez les vers au point et ajustez la position du condenseur en conséquence. Ajustez les puissances laser en fixant la puissance laser de la pompe à 200 milliwatts et la puissance IR à 400 milliwatts. Réglez l’amplificateur verrouillé pour la démodulation du signal SRS du ver.
Commencez à analyser le premier ver à un rythme d’analyse rapide, en ajustant la mise au point fine pour trouver la zone d’intérêt. Lorsque le signal a été optimisé, passez à un taux de balayage plus lent et à une résolution en pixels plus élevée pour obtenir l’image SRS et enregistrer l’image dans un format qui permet une haute résolution. Lorsque tous les échantillons ont été ginés, placez la source laser en veille et éteignez tout l’équipement associé.
Pour analyser les images, ouvrez les fichiers dans ImageJ et sélectionnez Analyser et définir les mesures pour sélectionner les propriétés à analyser. Utilisez l’outil de sélection de polygones pour décrire la région de l’intestin du ver à quantifier, puis cliquez à nouveau sur Analyser et mesurer. Les mesures apparaîtront dans la fenêtre de résultats.
Lorsque tous les vers ont été décrits, copiez et collez les mesures de chacun des vers d’un génotype donné dans une feuille de calcul. Pour la valeur de mesure d’arrière-plan, sélectionnez une zone à proximité du ver qui n’a pas de signal SRS et soustrayez la valeur grise moyenne d’arrière-plan de la mesure pour chaque ver individuel afin de calculer la moyenne et l’écart type des valeurs grises moyennes soustraites d’arrière-plan de tous les vers d’un génotype ou d’un groupe d’essai donné. Ces valeurs peuvent ensuite être normalisées à la moyenne du groupe témoin.
Dans cette analyse représentative, les niveaux intestinaux de lipide dans le type âge-synchronisés les vers sauvages et les mutants daf-2 manquant du récepteur d’insuline ont été quantifiés pendant l’âge adulte. Comme prévu, une baisse des taux de lipides est observée chez les vers de type sauvage, à partir du premier jour et jusqu’au neuvième jour de l’âge adulte. Les taux de lipides chez les mutants daf-2, cependant, augmentent jusqu’à ce qu’ils aient cinq jours, moment auquel ils restent constants à environ 2,5 à trois fois plus élevés que le type sauvage.
L’inactivation de Daf-16 supprime l’augmentation des taux de lipides des mutants daf-2. L’expression de l’isoforme daf-16a a ou daf-16b dans les doubles mutants daf-2, daf-16 ne restaure pas les taux de lipides. L’expression de l’isoforme de daf-16d/f/h, cependant, est suffisante pour reconstituer les niveaux de lipide dans daf-2, daf-16 doubles mutants aux niveaux observés dans les mutants simples daf-2.
Ces résultats indiquent que l’isoform de daf-16d/f/h module spécifiquement le métabolisme de lipide dans les vers de mutant daf-2. Il est important d’utiliser la même puissance laser pour la pompe et les faisceaux de Stokes tout au long de la session d’imagerie et d’inclure un groupe témoin dans chaque quantification cohérente de six et quatre. En plus de quantifier le stockage des lipides, la microscopie SRS peut être couplée avec des étiquettes bioorthogonales, telles que le deutérium, et mise en œuvre pour visualiser la dynamique de l’incorporation, de la synthèse et de la dégradation des lipides.
La microscopie SRS permet le multiplexage et peut être mise en œuvre pour imager plusieurs biomolécules dans différents compartiments subcellulaires. La microscopie SRS dite hyperspectrale a un grand avenir dans l’exploration de la dynamique métabolique.
