A microscopia de dispersão de Raman estimulada é uma tecnologia de imagem química que permite a detecção rápida e quantitativa de lipídios e permite o rastreamento de lipídios em animais vivos de forma livre de rótulos. A vantagem mais importante da microscopia SRS sobre as técnicas tradicionais de detecção de lipídios é que ela é livre de rótulos e, portanto, não é tão sustentável para branqueamento fotográfico como outras questões de fluorescência e coloração. O uso de microscopia SRS em conjunto com as ferramentas genéticas e bioquímicas disponíveis para organismos modelo, particularmente Caenorhabditis elegans fornece uma estrutura poderosa para estudar reguladores normais da biologia lipídica e metabolismo.
Para alimentar raios laser no microscópio SRS, primeiro, defina o periscópio para levantar o feixe de uma saída de fonte de luz picosegundo para a porta de entrada a laser infravermelha no scanner do microscópio e abra o software de controle a laser para iniciar os lasers. Abaixe a potência do laser da bomba para 50 miliwatts e coloque o sinal da bomba em 750 nanômetros. Use um expansor de feixe para ajustar o diâmetro do feixe para se adequar à abertura traseira dos objetivos do microscópio.
Use dois espelhos de relé, M1 e M2, para guiar o raio laser até o periscópio e definir os acenos do periscópio no centro da faixa de sintonia. Selecione a posição inicial e o ângulo de cada espelho de tal forma que o raio laser atinja aproximadamente o centro do espelho para lançar o feixe no microscópio e use uma porta vazia na torre objetiva do microscópio para realizar o alinhamento do curso. Coloque a sonda do medidor de energia na porta objetiva para medir a potência da luz transmitida e coloque o scanner do microscópio no zoom mais alto, 50X.
Meça o poder da luz transmitida com o ponto de raio laser focalado e otimize os botões dos espelhos M1 e M2 iterativamente para alcançar a maior potência laser transmitida. Use a ferramenta de alinhamento para realizar o alinhamento fino da luz transmitida para garantir que a luz esteja passando pelo centro do objetivo e coloque a tampa de alinhamento do alvo da fluorescência no assento objetivo vazio. Ajuste os botões do primeiro espelho de direção, M1, para centralizar o ponto de raio laser e introduza o tubo de extensão com a tampa de alinhamento na outra extremidade para um assento objetivo vazio para monitorar o ponto de feixe de laser.
Em seguida, sintonize os botões do segundo espelho de direção, M2, para centralizar novamente o ponto do feixe de laser na outra extremidade do tubo de extensão. Para configurar o módulo de detecção srs, coloque um cubo divisor de feixe após o condensador para direcionar o laser transmitido para o módulo de diodo fotográfico. Para configurar a conexão eletrônica, use um modulador eletro óptico embutido a 20 mega-hertz dentro do laser picosegundo para modular a intensidade do feixe stokes e alimentar o sinal de saída do diodo fotográfico no amplificador lock-in para demodulação da perda estimulada de Raman.
Em seguida, alimente a saída do amplificador de travamento na caixa analógica do microscópio para converter o sinal analógico elétrico em um sinal digital. Para otimizar as condições de imagem, adicione cinco microlitros de ácido oleico a uma mini câmara de slides de microscópio e cubra a amostra com um deslizamento de tampa. Coloque a amostra no estágio do microscópio e use a borda da almofada para localizar e focar na gota.
Ajuste o condensador para iluminação Kohler e use uma placa de sensor infravermelho e um visualizador infravermelho para verificar se o caminho do feixe da bomba ainda está correto. Confirme se o estágio de atraso é definido como zero femtosegundos e definir o comprimento de onda do feixe da bomba para 795,8 nanômetros. Defina a potência do feixe da bomba para 50 miliwatts e coloque o feixe de Stoke em 100 miliwatts.
Abra o obturador tanto para os feixes, quanto para o obturador principal do laser. Escaneie a amostra e verifique a imagem na tela do computador. Mude o modo de exibição para alto baixo e ajuste o alcance para ver uma saturação de aproximadamente 50%.
Verifique se a saturação está centrada na imagem, ajustando cuidadosamente os espelhos de direção dentro do sistema laser picosegundo para uma sobreposição otimizada da bomba e dos Stokes para maximizar a intensidade da imagem e centralizar a intensidade máxima conforme necessário. Antes de cada sessão de imagem, adicione 100 microliters de 2% de água quente a uma lâmina de vidro limpa colocada entre slides de suporte com duas camadas de fita de laboratório e coloque rapidamente um segundo slide em cima do primeiro slide. Gentilmente pressionado para criar uma almofada fina, uniforme, agarose e permitir que a agarose esfrie.
Para montar os vermes para imagens, coloque uma gota de quatro a cinco microliter de agente anestésico por 10 a 20 vermes em um deslizamento de cobertura e use um microscópio de dissecção para escolher os vermes a serem imagens, colocando os vermes na gota de anestesia à medida que são coletados. Quando todos os vermes tiverem sido coletados, cubra os vermes com o deslizamento de vidro com a almofada de agarose. Para imagens, monte a amostra de verme com o deslizamento de tampa voltado para a lente objetiva e direcione a fonte de luz de campo brilhante para a ocular para localizar os vermes.
Coloque os vermes em foco e ajuste a posição do condensador de acordo. Ajuste os poderes de laser ajustando a potência laser da bomba para 200 miliwatts e a energia IR para 400 miliwatts. Defina o amplificador de travamento para desmodulação do sinal SRS do worm.
Comece a digitalizar o primeiro worm a uma taxa de varredura rápida, ajustando o foco fino para encontrar a área de interesse. Quando o sinal for otimizado, mude para uma taxa de varredura mais lenta e uma resolução de pixels mais alta para obter a imagem SRS e salvar a imagem em um formato que permite alta resolução. Quando todas as amostras tiverem sido imagens, coloque a fonte de laser em prontidão e desligue todos os equipamentos associados.
Para analisar as imagens, abra os arquivos no ImageJ e selecione analisar e definir medidas para selecionar as propriedades a serem analisadas. Use a ferramenta de seleção de polígonos para delinear a região do intestino do verme a ser quantificada e clique em analisar e medir novamente. As medidas aparecerão na janela de resultados.
Quando todos os worms tiverem sido delineados, copie e cole as medidas para cada um dos vermes em um determinado genótipo em uma planilha. Para obter o valor de medição de fundo, selecione uma área nas proximidades do worm que não tenha nenhum sinal SRS e subtraia o valor cinzento médio de fundo da medição de cada verme individual para calcular o desvio médio e padrão dos valores médios de cinza subtraídos de todos os vermes em um determinado genótipo ou grupo de teste. Esses valores podem então ser normalizados para a média do grupo controle.
Nesta análise representativa, os níveis lipídicos intestinais em vermes do tipo selvagem sincronizados por idade e mutantes daf-2 sem o receptor de insulina foram quantificados durante a idade adulta. Como esperado, observa-se um declínio nos níveis lipídes de lipídios em vermes do tipo selvagem, começando no primeiro dia e continuando até o nono dia da idade adulta. Os níveis lipídes em mutantes daf-2, no entanto, aumentam até que tenham cinco dias de idade, momento em que permanecem constantes em cerca de 2,5 a 3 vezes mais alto que o tipo selvagem.
A inativação daF-16 suprime o aumento dos níveis lipídes de mutantes daf-2. Expressão do daf-16a a ou daf-16b isoform no daf-2, daf-16 mutantes duplos não restaura os níveis lipídes. A expressão da isoforma daf-16d/f/h, no entanto, é suficiente para restaurar os níveis lipídes em daf-2, daf-16 mutantes duplos aos níveis observados em mutantes solteiros daf-2.
Estes resultados indicam que a isoforme daf-16d/f/h modula especificamente o metabolismo lipídico em vermes mutantes daf-2. É importante usar a mesma potência laser para bombas e feixes de Stokes durante toda a sessão de imagem e incluir um grupo de controle em cada seis e quatro quantificações consistentes. Além de quantificar o armazenamento lipídico, a microscopia SRS pode ser acoplado a etiquetas bioortogonais, como o deutério, e implementada para visualizar a dinâmica da incorporação lipídica, síntese e degradação.
A microscopia SRS permite multiplexagem e pode ser implementada para imagem de múltiplas biomoléculas em diferentes compartimentos subcelulares. A chamada microscopia srs hiperespectral SRS tem um grande futuro na exploração da dinâmica metabólica.
