Die stimulierte Raman-Streumikroskopie ist eine chemische Bildgebungstechnologie, die den schnellen und quantitativen Nachweis von Lipiden ermöglicht und die Markierungssuche von Lipiden in lebenden Tieren ermöglicht. Der wichtigste Vorteil der SRS-Mikroskopie gegenüber herkömmlichen Lipiddetektionstechniken besteht darin, dass sie markierungsfrei ist und daher nicht so nachhaltig für das Photobleichen ist wie andere Fluoreszenz- und Färbeangelegenheiten. Die Verwendung der SRS-Mikroskopie in Verbindung mit den genetischen und biochemischen Werkzeugen, die für Modellorganismen, insbesondere Caenorhabditis elegans, zur Verfügung stehen, bietet einen leistungsfähigen Rahmen für die Untersuchung normaler Regulatoren der Lipidbiologie und des Stoffwechsels.
Um Laserstrahlen in das SRS-Mikroskop einzuspeisen, stellen Sie zunächst das Periskop so ein, dass es den Strahl von einem Pikosekunden-Lichtquellenausgang zum Infrarot-Lasereingangsanschluss am Scanner des Mikroskops hebt und die Lasersteuerungssoftware öffnet, um die Laser zu starten. Senken Sie die Pumpenlaserleistung auf 50 Milliwatt und stellen Sie das Pumpensignal auf 750 Nanometer ein. Verwenden Sie einen Strahlexpexplosor, um den Strahldurchmesser an die hintere Öffnung der Mikroskopziele anzupassen.
Verwenden Sie zwei Relaisspiegel, M1 und M2, um den Laserstrahl zum Periskop zu führen, und stellen Sie die Nicken des Periskops in der Mitte des Stimmbereichs ein. Wählen Sie die Ausgangsposition und den Winkel jedes Spiegels so, dass der Laserstrahl ungefähr auf die Mitte des Spiegels trifft, um den Strahl in das Mikroskop zu starten, und verwenden Sie einen leeren Anschluss am Objektivrevolver des Mikroskops, um die Kursausrichtung durchzuführen. Platzieren Sie die Leistungsmessersonde am Objektivanschluss, um die Leistung des durchgelassenen Lichts zu messen, und stellen Sie den Scanner des Mikroskops auf den höchsten Zoom, 50X, ein.
Messen Sie die Leistung des durchgelassenen Lichts mit dem fokussierten Laserstrahlspot und optimieren Sie die Drehknöpfe der Spiegel M1 und M2 iterativ, um die höchste übertragene Laserleistung zu erreichen. Verwenden Sie das Ausrichtungswerkzeug, um die Feinausrichtung des durchgelassenen Lichts durchzuführen, um sicherzustellen, dass das Licht durch die Mitte des Objektivs geht, und platzieren Sie die Ausrichtungskappe des Fluoreszenzziels auf dem leeren Objektivsitz. Stellen Sie die Knöpfe des ersten Lenkspiegels M1 so ein, dass der Laserstrahlspot zentriert wird, und führen Sie das Verlängerungsrohr mit der Ausrichtungskappe am anderen Ende in einen leeren Objektivsitz zur Überwachung des Laserstrahlspots ein.
Stimmen Sie dann die Knöpfe des zweiten Lenkspiegels, M2, ab, um den Laserstrahlpunkt wieder am anderen Ende des Verlängerungsrohrs zu zentrieren. Um das SRS-Detektionsmodul einzurichten, platzieren Sie einen Strahlteilerwürfel nach dem Kondensator, um den übertragenen Laser zum Fotodiodenmodul zu leiten. Um die Elektronikverbindung einzurichten, verwenden Sie einen eingebauten elektrooptischen Modulator bei 20 Megahertz im Pikosekunden-Tune-fähigen Laser, um die Intensität des Stokes-Strahls zu modulieren und das Ausgangssignal der Fotodiode in den Lock-in-Verstärker zur Demodulation des stimulierten Raman-Verlusts einzuspeisen.
Geben Sie dann den Lock-in-Verstärkerausgang in die analoge Box des Mikroskops ein, um das elektrische Analogsignal in ein digitales Signal umzuwandeln. Um die Bildgebungsbedingungen zu optimieren, fügen Sie fünf Mikroliter Ölsäure in eine Mini-Objektträgerkammer des Mikroskops ein und bedecken Sie die Probe mit einem Deckzettel. Legen Sie die Probe auf den Mikroskopstand und verwenden Sie den Rand des Pads, um den Tropfen zu lokalisieren und zu fokussieren.
Stellen Sie den Kondensator für die Kohler-Beleuchtung ein und überprüfen Sie mit einer Infrarot-Sensorkarte und einem Infrarot-Viewer, ob der Pumpenstrahlweg noch korrekt ist. Vergewissern Sie sich, dass die Verzögerungsstufe auf Null Femtosekunden eingestellt ist, und stellen Sie die Wellenlänge des Pumpstrahls auf 795,8 Nanometer ein. Stellen Sie die Leistung des Pumpenstrahls auf 50 Milliwatt und den Stoke-Strahl auf 100 Milliwatt ein.
Öffnen Sie den Verschluss sowohl für die Strahlen als auch für den Hauptverschluss des Lasers. Scannen Sie die Probe und überprüfen Sie das Bild auf dem Computerbildschirm. Ändern Sie den Anzeigemodus auf "Hoch niedrig" und passen Sie den Bereich so an, dass er eine Sättigung von ca. 50 % sieht.
Überprüfen Sie, ob die Sättigung im Bild zentriert ist, und passen Sie die Lenkspiegel im Pikosekunden-Tune-Able-Lasersystem sorgfältig an, um die Überlappung der Pumpe und des Stokes zu optimieren, um die Bildintensität zu maximieren und die Spitzenintensität nach Bedarf zu zentrieren. Fügen Sie vor jeder Bildgebungssitzung 100 Mikroliter warme 2% Agarose zu einem sauberen Glasobjektträger hinzu, der zwischen Stützobjektträgern mit zwei Schichten Laborband platziert wird, und legen Sie schnell einen zweiten Objektträger auf den ersten Objektträger. Vorsichtig gedrückt, um ein dünnes, gleichmäßiges Agarose-Pad zu erzeugen und die Agarose abkühlen zu lassen.
Um die Würmer für die Bildgebung zu montieren, legen Sie einen Tropfen Anästhetikum von vier bis fünf Mikrolitern pro 10 bis 20 Würmer auf einen Deckzettel und verwenden Sie ein Dissektionsmikroskop, um die zu bildesden Würmer auszuwählen, und legen Sie die Würmer auf den Tropfen der Anästhesie, während sie gesammelt werden. Wenn alle Würmer gesammelt wurden, bedecken Sie die Würmer mit dem Glasobjektträger mit dem Agarose-Pad. Für die Bildgebung montieren Sie die Wurmprobe mit dem Deckelrutsch zur Objektivlinse und richten Sie die Hellfeldlichtquelle auf das Okular, um die Würmer zu lokalisieren.
Bringen Sie die Würmer in den Fokus und passen Sie die Kondensatorposition entsprechend an. Stellen Sie die Laserleistung ein, indem Sie die Pumplaserleistung auf 200 Milliwatt und die IR-Leistung auf 400 Milliwatt einstellen. Stellen Sie den Lock-in-Verstärker für die Demodulation des Wurm-SRS-Signals ein.
Beginnen Sie mit dem Scannen des ersten Wurms mit einer schnellen Scanrate und passen Sie den Feinfokus an, um den interessierenden Bereich zu finden. Wenn das Signal optimiert wurde, wechseln Sie zu einer langsameren Abtastrate und einer höheren Pixelauflösung, um das SRS-Bild zu erhalten und das Bild in einem Format zu speichern, das eine hohe Auflösung ermöglicht. Wenn alle Proben abgebildet wurden, stellen Sie die Laserquelle in den Standby-Modus und schalten Sie alle zugehörigen Geräte aus.
Um die Bilder zu analysieren, öffnen Sie die Dateien in ImageJ und wählen Sie Analysieren und Festlegen von Messungen, um die zu analysierenden Eigenschaften auszuwählen. Verwenden Sie das Polygonauswahlwerkzeug, um die region des zu quantifizierenden Wurmdarms zu skizzieren, und klicken Sie erneut auf Analysieren und Messen. Die Messungen werden im Ergebnisfenster angezeigt.
Wenn alle Würmer skizziert wurden, kopieren Sie die Messungen für jeden der Würmer in einem bestimmten Genotyp und fügen Sie sie in eine Tabelle ein. Wählen Sie für den Hintergrundmesswert einen Bereich in der Nähe des Wurms aus, der kein SRS-Signal aufweist, und subtrahieren Sie den Hintergrundmittel-Grauwert von der Messung für jeden einzelnen Wurm, um den Durchschnitt und die Standardabweichung der im Hintergrund subtrahierten mittleren Grauwerte von allen Würmern in einem bestimmten Genotyp oder einer bestimmten Testgruppe zu berechnen. Diese Werte können dann auf den Durchschnitt der Kontrollgruppe normalisiert werden.
In dieser repräsentativen Analyse wurden die intestinalen Lipidspiegel bei alterssynchronisierten Wildtypwürmern und Daf-2-Mutanten, denen der Insulinrezeptor fehlt, im Erwachsenenalter quantifiziert. Wie erwartet, wird bei Wildtypwürmern ein Rückgang der Lipidspiegel beobachtet, der am ersten Tag beginnt und bis zum neunten Tag des Erwachsenenalters andauert. Die Lipidwerte in Daf-2-Mutanten steigen jedoch an, bis sie fünf Tage alt sind, dann bleiben sie konstant bei etwa 2,5 bis dreifach höher als der Wildtyp.
Die Daf-16-Inaktivierung unterdrückt den Anstieg der Lipidspiegel von Daf-2-Mutanten. Die Expression der daf-16a a oder daf-16b Isoform in den daf-2, daf-16 Doppelmutanten stellt die Lipidspiegel nicht wieder her. Die Expression der daf-16d/f/h-Isoform reicht jedoch aus, um die Lipidspiegel in daf-2, daf-16 Doppelmutanten auf das Niveau wiederherzustellen, das bei daf-2 Einzelmutanten beobachtet wurde.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die daf-16d/f/h-Isoform den Fettstoffwechsel in daf-2-mutierten Würmern spezifisch moduliert. Es ist wichtig, während der gesamten Bildgebungssitzung die gleiche Laserleistung für Pumpen- und Stokes-Strahlen zu verwenden und eine Kontrollgruppe in alle sechs und vier konsistenten Quantifizierungen einzubeziehen. Zusätzlich zur Quantifizierung der Lipidspeicherung kann die SRS-Mikroskopie mit bioorthogonalen Tags wie dem Deuterium gekoppelt und implementiert werden, um die Dynamik des Lipideinbaus, der Synthese und des Abbaus zu visualisieren.
Die SRS-Mikroskopie ermöglicht Multiplexing und kann implementiert werden, um mehrere Biomoleküle in verschiedenen subzellulären Kompartimenten abbilden zu können. Die sogenannte hyperspektrale SRS-Mikroskopie hat eine große Zukunft bei der Erforschung der Stoffwechseldynamik.
