Стимулированная рамановская рассеянная микроскопия - это технология химической визуализации, которая позволяет быстро и количественно обнаруживать липиды и позволяет отслеживать липиды у живых животных без маркировки. Наиболее важным преимуществом микроскопии SRS перед традиционными методами обнаружения липидов является то, что она не содержит этикеток и, следовательно, не так устойчива к фотоотбеливанию, как другие флуоресцентные и окрашивающие вещества. Использование микроскопии SRS в сочетании с генетическими и биохимическими инструментами, доступными для модельных организмов, в частности Caenorhabditis elegans, обеспечивает мощную основу для изучения нормальных регуляторов липидной биологии и метаболизма.
Чтобы подать лазерные лучи в микроскоп SRS, сначала установите перископ на подъем луча от пикосекундного выхода источника света к входному порту инфракрасного лазера на сканере микроскопа и откройте программное обеспечение для управления лазером для запуска лазеров. Уменьшите мощность лазера накачки до 50 милливатт и установите сигнал накачки на 750 нанометров. Используйте расширитель луча для регулировки диаметра луча в соответствии с задней диафрагмой объективов микроскопа.
Используйте два релейных зеркала, M1 и M2, чтобы направить лазерный луч к перископу и установить кивки перископа в центре диапазона настройки. Выберите начальное положение и угол каждого зеркала таким образом, чтобы лазерный луч примерно ударял по центру зеркала, чтобы запустить луч в микроскоп и использовать пустой порт на целевой башне микроскопа для выполнения выравнивания курса. Поместите датчик мощности на объективный порт для измерения мощности проходящего света и установите сканер микроскопа на самый высокий зум, 50X.
Измерьте мощность проходящего света с помощью сфокусированного лазерного луча и оптимизируйте ручки зеркал M1 и M2 итеративно для достижения максимальной мощности передаваемого лазера. Используйте инструмент выравнивания для выполнения точного выравнивания проходящего света, чтобы убедиться, что свет проходит через центр объектива, и поместите колпачок выравнивания флуоресцентной цели на пустое целевое сиденье. Отрегулируйте ручки первого рулевого зеркала, M1, чтобы центрировать пятно лазерного луча и ввести удлинительную трубку с колпачком выравнивания на другом конце на пустое целевое сиденье для мониторинга пятна лазерного луча.
Затем настройте ручки второго рулевого зеркала, M2, чтобы снова центрировать точку лазерного луча на другом конце удлинительной трубки. Чтобы настроить модуль обнаружения SRS, поместите куб светоотвода после конденсатора, чтобы направить передаваемый лазер на фотодиодный модуль. Чтобы настроить электронное соединение, используйте встроенный электрооптический модулятор на 20 мегагерц внутри пикосекундного настраиваемого лазера для модуляции интенсивности луча Стокса и подачи выходного сигнала фотодиода в блокирующий усилитель для демодуляции стимулированных рамановских потерь.
Затем подать выход с фиксацией усилителя в аналоговую коробку микроскопа для преобразования электрического аналогового сигнала в цифровой. Чтобы оптимизировать условия визуализации, добавьте пять микролитров олеиновой кислоты в слайдовую камеру мини-микроскопа и накройте образец крышкой. Поместите образец на ступень микроскопа и используйте край прокладки, чтобы найти и сфокусироваться на капле.
Отрегулируйте конденсатор для освещения Kohler и используйте инфракрасную сенсорную карту и инфракрасный просмотрщик, чтобы проверить, является ли траектория луча насоса все еще правильной. Убедитесь, что стадия задержки установлена на ноль фемтосекунд и установите длину волны пучка насоса на 795,8 нанометра. Установите мощность пучка насоса на 50 милливатт, а пучка Стока на 100 милливатт.
Откройте затвор как для лучей, так и для основного затвора лазера. Отсканируйте образец и проверьте изображение на экране компьютера. Измените режим отображения на высокий низкий и отрегулируйте диапазон, чтобы увидеть насыщенность примерно на 50%.
Проверьте, центрирована ли насыщенность изображения, тщательно регулируя рулевые зеркала внутри пикосекундной настраиваемой лазерной системы для оптимизации перекрытия накачки и Стокса, чтобы максимизировать интенсивность изображения и при необходимости центрировать пиковую интенсивность. Перед каждым сеансом визуализации добавляйте 100 микролитров теплой 2%-агарозы на чистый стеклянный слайд, размещенный между опорными слайдами с помощью двух слоев лабораторной ленты, и быстро поместите второй слайд поверх первого слайда. Осторожно нажимают, чтобы создать тонкую, ровную, агарозную прокладку и дать агарозе остыть.
Чтобы установить червей для визуализации, поместите от четырех до пяти микролитров капли анестетика на 10-20 червей на крышку и используйте микроскоп рассечения, чтобы выбрать червей для изображения, помещая червей на капельку анестезии по мере их сбора. Когда все черви будут собраны, накройте червей стеклянной горкой с агарозной подушечкой. Для получения изображения установите образец червя с крышкой, обращенной к объективу, и направляйте источник света яркого поля на окуляр, чтобы найти червей.
Поместите червей в фокус и отрегулируйте положение конденсатора соответствующим образом. Отрегулируйте мощность лазера, установив мощность лазера накачки на 200 милливатт, а мощность ИК на 400 милливатт. Установите блокирующий усилитель для демодуляции червячного сигнала SRS.
Начните сканирование первого червя с высокой скоростью сканирования, регулируя тонкий фокус, чтобы найти интересующую область. Когда сигнал будет оптимизирован, переключитесь на более медленную скорость сканирования и более высокое разрешение пикселей, чтобы получить изображение SRS и сохранить изображение в формате, обеспечивающем высокое разрешение. Когда все образцы будут получены, поместите лазерный источник в режим ожидания и выключите все соответствующее оборудование.
Чтобы проанализировать изображения, откройте файлы в ImageJ и выберите «Анализировать и устанавливать измерения», чтобы выбрать свойства для анализа. Используйте инструмент выделения полигонов, чтобы очертить область кишечника червя, которая должна быть количественно определена, и снова щелкните анализ и измерение. Измерения появятся в окне результатов.
Когда все черви будут описаны, скопируйте и вставьте измерения для каждого из червей в данном генотипе в электронную таблицу. Для значения фонового измерения выберите область в непосредственной близости от червя, которая не имеет сигнала SRS, и вычтите фоновое среднее значение серого цвета из измерения для каждого отдельного червя, чтобы рассчитать среднее и стандартное отклонение фона, вычитаемого среднего серого значения из всех червей в данном генотипе или тестовой группе. Затем эти значения могут быть нормализованы до среднего значения контрольной группы.
В этом репрезентативном анализе уровни липидов кишечника у синхронизированных по возрасту червей дикого типа и мутантов daf-2, не имеющих рецептора инсулина, были количественно определены во взрослом возрасте. Как и ожидалось, снижение уровня липидов наблюдается у диких червей, начиная с первого дня и продолжаясь до девятого дня взрослой жизни. Однако уровни липидов у мутантов daf-2 увеличиваются до тех пор, пока им не исполнится пять дней, и в этот момент они остаются постоянными примерно в 2,5-три раза выше, чем у дикого типа.
Инактивация Daf-16 подавляет повышение уровня липидов мутантов daf-2. Экспрессия изоформы daf-16a a или daf-16b в двойных мутантах daf-2, daf-16 не восстанавливает уровни липидов. Однако экспрессия изоформы daf-16d/f/h достаточна для восстановления уровней липидов у двойных мутантов daf-2, daf-16 до уровней, наблюдаемых у одиночных мутантов daf-2.
Эти результаты показывают, что изоформа daf-16d/f/h специфически модулирует липидный обмен у мутантных червей daf-2. Важно использовать одну и ту же мощность лазера для пучков и лучей Стокса на протяжении всего сеанса визуализации и включать контрольную группу в каждые шесть и четыре последовательных количественных оценки. В дополнение к количественной оценке хранения липидов, микроскопия SRS может быть соединена с биоортогональными метками, такими как дейтерий, и реализована для визуализации динамики включения, синтеза и деградации липидов.
Микроскопия SRS позволяет мультиплексировать и может быть реализована для изображения нескольких биомолекул в разных субклеточных компартментах. Так называемая гиперспектральная микроскопия SRS имеет большое будущее в изучении метаболической динамики.
