これは、ヒト乳房組織とヒト乳癌との相互作用の研究を直接可能にする、ヒト乳房組織を長期間生きて維持することを可能にする最初のプロトコルである。この技術の主な利点は、乳房アディポサイト、免疫細胞、血管構造、管構造および細胞外マトリックスを含むヒト乳房組織の巨視的な部分を生き続けることを可能にすることである。この技術は、個別化医療、医薬品開発、腫瘍開始の病態生理学、線維症や細胞外マトリックスリモデリングなどの遅い乳癌プロセスを含む乳癌研究のいくつかの分野に大きな影響を与えます。
この手順を実証するには、トゥレーン大学院生のキャサリン・ヘバートと、私の研究室のトゥレーン医学生のラケシュ・グララです。まず、調製したゼラチン溶液を摂氏37度の水浴で溶かします。5または10ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、この溶液の2.5ミリリットルを6つのウェルプレートの井戸のプランジャーに分配します。
ゼラチンが固まったら、pNIPAAmコード化されたASCプレートをバイオセーフティキャビネットに移動します。ゼラチンがASCに接触するように、これらのプレートの井戸に慎重に突っ込みを置きます。プランジャーに金属ワッシャーを置き、ゼラチンが室温で30分間ASCシートに直接接触するように計量します。
プランジャー付きのプレートをバイオセーフティキャビネットの滅菌箱にそっと動かし、蓋をします。箱を4度冷蔵庫に移動するか、プレートを氷の上に置き、バイオセーフティキャビネットにアイスバケツを30分間置きます。バイオセーフティキャビネットでは、ヒト乳房組織を10ミリリットルの無菌PBSで3回洗浄します。
無菌鉗子とカミソリの刃を使用してBC-MPSを粗くミンチし、できるだけ多くの筋膜および結合組織を除去してみてください。結合組織が除去されたら、滅菌カミソリの刃を使用して、均質な液体の一貫性が保たれるまで組織を最終的にミンチします。P1000ピペットチップの先端を切り、ひき肉をピペット化します。
1.5ミリリットルチューブで、テキスト原稿に記載されているようにミンチ組織、癌細胞株およびBC-MPS培地を組み合わせる。底部のセルシートに使用するACSプレートをインキュベーターからバイオセーフティキャビネットに移動し、プレートからメディアを吸引します。作製した乳房組織混合物をカットピペットチップを使用して底部ACSプレートのウェルの中央にピペットし、プランジャー付き上部ACSプレートを含むボックスをバイオセーフティキャビネットに移動させる。
pNIPAAmコーティングされたプレートからゼラチンプランジャーを静かに取り出し、組織混合物の上に置きます。BC-MPSメディアをウェルに追加し、BC-MPS混合物とプランジャーを使用して底部のACSプレートを滅菌プラスチックボックスに慎重に移動します。輸送のために箱の蓋を置き、培養物の汚染を避けるように注意してください。
底板を箱に入れ、ゼラチンが溶けて最上のACS層が底層に付着し始めるまで、37°Cのインキュベーターをインキュベートします。その後、プレートと一緒に箱をバイオセーフティキャビネットに移動させ、下のプレートからプランジャーを静かに取り外し、癌細胞を井戸の底に固定した組織を観察します。6ウェルプレートの蓋を底板に戻し、37度でインキュベートしてゼラチンを完全に溶かし、最上層を底層に固定させます。
プレートをバイオセーフティキャビネットにそっと移動し、10ミリリットルの血清ピペットで井戸の端からメディアを吸引します。組織を取り出さないように、各井戸の端に新鮮な培地を2ミリリットル加えます。BC-MPSを摂氏37度、二酸化炭素を5%の二酸化炭素で所望の時間維持します。
2~3日ごとにメディアを交換する。BC-MPSを分析する準備ができたら、プレートをバイオセーフティキャビネットに移動します。セロロジカルピペットでメディアを除去し、偶発的な組織の脱外を避けます。
各井戸にPBSの1つのボリュームを追加します。その後、血清ピペットでPBSを取り除く。各ウェルに1ミリリットルの細胞解離液を加え、プレートをインキュベーターに5分間戻して、この細胞を取り外します。
インキュベーション後、細胞スクレーパーを使用して、細胞および組織をバイオセーフティキャビネット内の培養プレートから完全に剥離します。組織と一緒に溶液を15ミリリットルの円錐管に移し、2ミリリットルのPBSを加えて残りの細胞を採取する。細胞が蛍光性の場合は、チューブをアルミホイルで包みます。
1回Gで一定の攪拌下で37度のチューブを10〜20分間インキュベートし、組織から細胞を完全に解離する。バイオセーフティキャビネットでは、血清学的ピペットを使用して、チューブ内の細胞の残りの塊を破壊します。そして、250マイクロメートルのティッシュのストレーナーを通して新しい15ミリリットルの管にサンプルをフィルターする。
残りの細胞を収集するためにPBSの1ミリリットルでストレーナーをすすいでください。サンプルを室温で500倍にして5分間遠心し、最上層に浮遊するアディポサイトを癌細胞とASCとペレットに混ぜ合わせて分離する。鈍い切りピペットの先端を使用して新しい管にアディポサイト層を移す。
サンプルを再び遠心分離し、シリンジと針を使用して、残りの溶液を葉分の下から取り除きます。細胞ペレットを破壊することなく、ASCおよび癌細胞を含むチューブから残りの溶液を吸引する。PBSまたはBC-MPS培地中のペレットを再懸濁し、フローサイトメトリーを使用して蛍光に基づいて細胞を選別します。
コンフルエントASCシートのストリエイドパターンがここに示されています。浮力のあるヒト乳房組織は、14日間培養した後も、ASC細胞シートによってウェルの底に固定された安定であった。蛍光顕微鏡画像は、14日後にRFP細胞株を発現し、少なくとも6日間はトリプルネガティブ腫瘍外植PDXを有するMDA-MB-231を用いたBC-MPSの安定性を示す。
乳房組織を含むBC-MPSを14日間インビトロで培養し、染色および画像を100Xおよび20倍倍で組織のネイティブ要素を実証した。マクロファージマーカーの染色は、培養中の3日および7日後の主要マクロファージの保存を示すために使用した。14日後にボディス染色MDA-MB-231細胞のフローサイトメトリー分析は、2D培養および広範な脂質蓄積およびBC-MPSにおける最小限の脂質蓄積を示す。
脂質陽性MDA-MB-231細胞の割合は、2D培養よりもBC-MPSにおいて26.2倍大きかった。表示されたBC-MPSで培養した細胞は、標準2D培養で培養した細胞と比較して脂質滴を増加させる。MDA-MB-231細胞を有するBC-MPSと標識されたRFPのタイムラプス画像は、擬似ポッドおよび高運動性を有する231細胞のアメーバ運動を示した。
乳房組織は十分に小さく細かく刻み、井戸の底部に分布するのに十分分離されなければならない。乳房組織は非常に浮力があり、破片が大きすぎるか、あまりにも密接に一緒にクラスター化されている場合、ASC細胞シートは乳房組織を井戸の底に固定することはできません。得られた乳房組織癌構築物は、特定の細胞タイプの関心を単離するために酵素消化を受けることができる。
これにより、乳房組織の癌細胞が従来の2D培養やオルガノイドと比較して化学療法にどのように反応するかなどの重要な質問に答えが可能になります。
