Name: an ex vivo model to study hormone action in the human breast
Uploaded: 2015-01-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
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著者は、乳房形成の写真を提供するためのローザンヌ大学病院のM.マイクロフィッシュ、M.ワース·実験癌研究のためのスイスの研究所のA. Ayyanan、研究分子腫瘍、生命科学の学校、エコール連邦工科·デ·コンピテンスのナショナルセンターに感謝批判的なコメントのためにマンチェスター大学の技術支援のためのローザンヌとR·クラーク。これらの結果につながる研究なしグラント契約の下でSNF3100A0-112090、Oncosuisse 531817、および革新的な医薬品イニシアティブ共同事業の支援を受けている。 115188、現物出資における製薬産業と協会の企業の欧州連合の第7次フレームワークプログラム（FP7 / 2007年から2013年）と欧州連合からの財政貢献」で構成されているの資源。革新的な医薬品イニシアティブのWebアドレスです<a href="http://www.imi.europa.eu/" target="_blank">http://www.imi.europa.eu/</a> 。&lt;/ pの&gt;

一般的な考慮事項：前もって、倫理プロトコルを設定するには、患者のためのアンケートを作成し、臨床的な人材の育成に参照してください。削減乳房形成手術から材料を使用する前に、権限を調達し、患者の同意を確保する。組織は、感染し、それに応じて処理する必要があります。実験的癌研究スイス研究所 - このプロトコルはISRECの倫理委員会によって承認された。 1.組織の回復、加工、バイオバンキングバイオバンキングのための最適なサンプルの品質を確保するために、ステップの数は、実験室に輸送する前に病院で行われる。 病院で： <ol><li>必要であれば、縮小乳房形成術および血液試料から無菌条件下で、ヒト乳房組織を得る。組織は、悪性病変の存在を除外するサンプリングする病理学者によって検査される必要がある。 </li><li>胸tを置きます無菌のボード上のボンネットの下に発行し、はさみ、外科用メス、すでに蒸気滅菌器で滅菌されたピンセットを準備します。それを開くためにメスを用いて乳房組織の異なる部位で深いカットを行います。黄色の脂肪組織中に埋め込まれている管および小葉からなる白色ストランド、ヒトの乳房組織の外観である。 注：黄色の脂肪組織に白の実質の比率は、女性の間で異なっている。一般的に若い女性がより多くの上皮組織を持っている。 </li><li>その後はさみで脂肪組織から優しくそれらを分離、白い材料片を選び、鉗子でそれらを保持する。血管を取ることは避けてください。 </li><li>血液を除去するためにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）pHが7.2で組織片をリンスする。と1％のAN（5000単位/ mlのペニシリンおよび5000グラム/ mlのストレプトマイシンを含む）2％ペニシリン/ストレプトマイシンとフェノールレッドを含まないF12培地（ダルベッコ改変イーグル培地F12）を含む250ミリリットルのペットボトルに組織を転送tibiotic /アンホテリシンBは、（10,000単位/ mlのペニシリン、ストレプトマイシン10,000 / mlの、およびアムホテリシンB25μg/ mlを含む）。研究室への輸送のための媒体で保管して組織。 </li><li>冷たい（ドライアイス）イソペンタンでクライオバイアルでそれらを凍結するRNAとタンパク質の抽出およびフラッシュ用の直径5mm - 3の部分を準備します。研究室への輸送のためにドライアイスボックスに転送する。 </li><li>金型には5mmと最適切削温度（OCT）の層でそれをカバーして、冷たいイソペンタンで満たされた箱の平らな底に金型を配置 - 3のピースを置く。完全な凍結後にドライアイスボックスに金型を転送する。 </li><li>ホルムアルデヒド中でパラホルムアルデヒドで直径5mm（PFA）4％と、他の5個（FA）後でRT組織学的分析では、PBS中4％ - 3の5作品を修正する。いくつかの抗体は、より良い1つまたは2つの相互に働くように、2つの異なる固定剤を推奨します。 </li></ol>研究室では： <ol start="8"><li>やる、削減乳房形成に関するすべての情報をcument手術日とサンプルが右乳房対左から派生しているかどうか。 </li><li> -80℃で凍結サンプルを配置し、固定の2時間後に組織学カセットに固定した組織を移す。その後、4℃でO / N保存のために、PBS中70％エタノールのいずれかに置く。翌日、パラフィン包埋のため組織学施設に組織学カセットを転送する。 </li></ol> 2.組織消化とホルモン刺激<ol><li> P2の細胞培養室で層流キャビネットに組織サンプルを含むボトルに移す。無菌のまな板（29×19 cm）の上の組織片を置きます。鉗子で材料を保持し、メスで離れて乳房実質（白い部分）から残りの脂肪と血管をこすり。 10cmの培養皿にPBSに白色物質を配置します。 </li><li>すべての部分からの脂肪物質を除去し、安全性の規則に従って、それらを配置した後研究室のSは、バックチョッピングボード上の上皮組織を含む白色パーツを配置。対向するメスを使用して、組織を切断し、最大直径2mmの断片に切る。 </li><li>適切なサイズのチューブにみじん切り素材を配置：1、2.5及び10ミリリットルまでを5、15または50ミリリットルチューブに、それぞれ。典型的には、5 mlチューブ利回り十分なパラフィン埋め込みやホルモンの刺激のための材料、および蛍光活性化細胞のための15ミリリットルチューブ利回り十分な材料選別（FACS）。より大きなチューブは分量を凍結するために使用されている。 </li><li> 1％ペニシリン/ストレプトマイシン/アンホテリシンBおよびコラゲナーゼA（ ヒストリチクス菌からClostridiopeptidase A）と培地からなる消化マスターミックス（フェノールレッドなしのDMEM / F12）を準備します。消化時間に応じてコラゲナーゼ線量。 <ol><li> 12、24、インキュベーションの36時間、1.5 mg / mlで、1.0 mg / mlのおよび0.5mg / mlのそれぞれのコラゲナーゼの最終濃度を使用する。の4倍に消化マスターミックスを加える消化された材料の量は、十分な攪拌と通気を確保する。 注：実験計画とホルモン刺激の継続期間に応じて、中または酵素消化工程および微細構造回復後のいずれかのホルモンを追加します。 </li></ol></li><li>サンプルおよびコントロールの車両をテストするために所望の濃度でホルモン（複数可）を追加する。 17-βエストラジオール、及びプロメゲストン（R​​5020）による刺激のために20nmの最終濃度を使用しています。 NOTE：R5020培地中の天然プロゲステロンよりも安定である合成プロゲステロン受容体アゴニストである。 <ol><li> 37℃のインキュベーターと40 rpmでO / N内部のローラーミキサー上に置きチューブ。ミキサーでサンプルを配置する前に、すべての物質が遠心管に沿って分散していることを確実にするために非常によく再懸濁します。 </li></ol></li><li>消化は12未満の時間のホルモン刺激の回で少なくとも12時間（O / N）をとるように、（微細構造の回復の後にホルモンを追加するデステップ3の下につかれた）。あなたは微細構造を再懸濁し、超低付着プレートにサスペンションを置くようにホルモンを追加します。組織の微細構造は、約70％の生存率を維持する成長因子を含まない培地中で7日間までの超低付着プレートに保つことができる。 </li><li> RNAおよびタンパク質分析のために、遠心分離管中で5分間フラッシュ凍結、400×gで遠心分離することによって、組織の微細構造を集める。 </li></ol>組織微細構造の3回復<ol><li> 5分間400×gでチューブ（単数または複数）を遠心する。遠心管の上部から脂肪を吸引し、5分間1250×gで新しい遠心チューブと遠心分離機に、線維芽細胞が濃縮され、残った水性上清、上清を移す。 注：以降のすべてのステップが軽くチューブを攪拌することによってペレットを再懸濁するために乳房組織の微細構造は、非常に粘着性であるので。ピペッティングは、材料を失うリスクにはお勧めしません。 </lI&gt; <li>微細構造およびPBS、2％ウシ胎児血清（FCS）、水性上清由来の線維芽細胞に富むペレットを再懸濁する。その後5分間1250×gで両方の管を回転した後、上清を捨てる。 </li><li> 3にペレットを再懸濁 - 5mlの赤血球血液溶解緩衝液チューブを洗浄するためにそれらを転送する。室温で5分間のためにそれらをインキュベートします。 </li><li> PBS、2％FCSの2倍のボリュームを追加し、5分間1250×gで、それらを遠心する。 5分間1250×gでPBS、2％FCSおよび遠心機でペレットを洗ってください。二回、この手順を繰り返します。 </li></ol>フローサイトメトリー用4.サンプル<ol><li>ペレットに0.25％トリプシン2ミリリットル、細胞を解離するために千μlのピペットマンで2分間非常に優しく上下にピペッティングすることによって、それをミックスして - 1を追加します。 </li><li> 9ミリリットルPBS、2％FCSを添加することにより、トリプシン活性を阻害する。 5分間450×gで遠心分離し、10mlのPBS、2％FCS中でペレットを再懸濁。 </li><li>トンに置か40μmのセルストレーナー上に細胞懸濁液を転送単一の細胞を調製するための50mlの遠心分離管のオペアンプ。細胞懸濁液を数マイクロリットルのフィルターの上部に残っている場合、それらは、ピペットでストレーナの反対側からそれらを吸引することにより、フィルタを通過し、濾過した微細構造に追加助ける。 </li><li>その後、別個の免疫細胞、抗CD45のカクテルを微細構造からの線維芽細胞および内皮細胞、抗FAPおよび抗CD31抗体とは、それぞれ、10管腔、基底細胞を分離するための汎上皮マーカーのEpCAMおよびCD10に基づいて、FACSで並べ替える。 </li></ol>組織学のために5.サンプル<ol><li>上記のように機械的および酵素的に消化された物質を洗浄した後、室温で30分間PBS中の4％PFAを1mlの1.5ミリリットル初期材料からペレットを固定する。 </li><li> 5分間1250×gで遠心分離し、および1で洗浄する - 二回2mlのPBS。 </li><li> 10分間16000×gで遠心分離する。この間、トリス - 酢酸-EDTA（1％多目的アガロースを準備TAE）の緩衝液溶液が沸騰になるまで電子レンジで溶液を加熱する。 <ol><li>電子レンジから溶液を除去し、溶液を混合し、残りのアガロース粒子を再懸濁させ軽くフラスコを旋回。 50℃に冷却し、アガロース溶液及びパラフィンベースモールド1mlのを注ぐ31×23×13.5ミリメートルの大きさ。 </li></ol></li><li>上清を捨て、固化層の上にペレットを配置 - フラットエンドとのへらを用いてアガロースの（1〜3ミリ）。アガロースの追加層（40℃）でそれらすべてをカバーしています。 </li><li>アガロースが固化した後、通常は5分以内で、パラフィン埋め込みのための組織学カセットにアガロースブ​​ロックを配置。サンプルは、鉛筆の小さな文字で書かれた削減乳房形成数、実験条件、および日付に関するすべての情報をカセットに白い事務用紙を置き、アガロースとともに。この書き込みは、以降のすべての処理工程に耐える。 </li><li>にカセットを入れてPBS O / N、または4℃で週末の保存のために70％エタノール中。我々は2つ​​のストレージ·ソリューションとの間に何の違いも気づいていない。そして、パラフィン包埋のために組織学施設に組織学カセットを転送する。 </li></ol> 6.凍結微細構造（今後の培養） <ol><li> 10％のジメチルスルホキシド（DMSO）にFCSからなるとクライオバイアル内の1mLのアリコートを凍結する凍結培地中に再懸濁し、組織の微細構造。得られたクライオバイアルの数が削減乳房形成から得られた一次材料の量に依存します。 </li><li>以下のプログラムを用いて制御された速度の冷凍庫を使用して、組織の微細構造を含むクライオバイアルを凍結：5分でC -12℃に温度を下げ、6℃/分の速度で-7℃の温度を下げ、4℃で住居6℃/分、10分住居の速度、6℃/分の速度で-40℃まで温度を下げて-80℃に温度を下げる6℃/分の速度。その後、Cの冷凍庫-80℃に凍結バイアルを転送します。 </li><li>翌日、長期保存のために液体窒素タンクに-80℃からクライオバイアルを移す。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もない。

ここで説明するのex vivo培養は、通常、ヒト女性の胸肉で見つかった他の細胞型と一緒に、完全な管および小葉を含む乳房 ​​組織の微細構造を提供しています。ヒト乳房組織の処理では、通常の還元mammoplasties、脂肪組織の除去、間質マトリックスの機械的および酵素的消化から得られ、そして赤血球の溶解は、乳管フラグメントおよび端子乳管小葉単位富化。右の存続期間のための?...

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Erratum: An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

乳癌における突然変異景観に関する情報は、急速に増加している。以下の注意は、乳癌の発達に影響を与える全身性因子が注目されている。生殖ホルモンへの曝露は、疾患の進行1-3に大きな影響を与えます。しかし、生殖ホルモンはヒト乳房に衝突するメカニズムはよく理解されていない。遺伝子操作したマウスモデルとの仕事は、彼らがいくつかの下流エフェクター4を介して細胞内因性および傍分泌に関与することを明らかにした。 ヒト乳癌におけるホルモン作用についての限られた知識は、適切なモデルの欠如に主に起因している。エストロゲン受容体（ER）およびプロゲステロン受容体（PR）のシグナル伝達のメカニズムのほとんどの作業は、MCF-7およびT47Dなどのホルモン受容体陽性乳癌細胞株を用いて行われた。これらはalreaいた進行乳癌患者からの胸膜滲出液由来したDYは、複数の治療法5を受け取った。ヒト乳房のような単純なin vitroモデルにおける知見の生物学的関連性は、これらのin vitroモデルで識別さ疑わしいとターゲット遺伝子である動物モデル6で識別された標的遺伝子とは異なります。初代ヒト乳房上皮細胞は、インビトロで培養される場合、それらは、ホルモン受容体の発現、したがって、ホルモン応答7,8を失う傾向がある。この問題は、マトリゲルを使用して洗練された3Dアプローチによってcircumventdすることができます。このように、C·クラークらは、ホルモン受容体の発現を維持し、プロゲステロン刺激9に対する増殖応答を示した乳房上皮細胞を樹立することに成功した。しかし、 生体内プロゲステロン受容体標的遺伝子において重要な二つのWnt-4、RANKL、このシステム9プロゲステロン刺激により誘導されなかった。このアプローチは、最近、 インビトロでさらに上に撮影された</em&gt;のホルモン治療前とRANKL誘導は10を達成した。注意点は、マトリゲルはバッチに依存している活動があることに変わりは高価であり、わずかな細胞数のためになりやすい実験計画を要求する。 インビボでの ERおよびPRシグナル伝達に主としてパラクリン相互作用11によって媒介されるという知見に基づいて、我々は、細胞間相互作用が維持される必要があると主張した。組織は、インビトロ培養のために単一細胞に解離されると失われたもう一つの重要な要因は、細胞外マトリックスと上皮細胞との相互作用である。まだこれらは、上皮分化のために重要であり、その破壊は、腫瘍形成において重要である12。これを念頭において、私たちは新鮮な外科廃棄材13から乳房組織の微細構造を分離する方法を確立した。インナー腔側と外側myoepitheliで二層上皮からなる乳房実質、らの細胞は、脂肪組織から離れて切開し、機械的および酵素的解離に供される。洗浄および遠心分離後、乳管の断片は、多くの間質​​細胞との密接な相互作用を維持することが求​​められる。これらの組織の微細構造は、ホルモン応答残る。モデルは、臨床検体13に検証されました。このように、本手順では、生物学的および臨床的に関連する文脈において乳癌におけるホルモン作用を研究するために助けることができる。

<table><tbody><tr><td>Microlitre Centrifuge</td><td>Heraeus Biofuge Fresco</td><td>75005521</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>5810 000.327</td><td></td></tr><tr><td>Cryobox</td><td>Nalgene&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Controlled Rate Freezer EF600 Grant</td><td>Asymptote&amp;nbsp;</td><td>EF600</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Hera Cell Heraeus</td><td>51022391</td><td></td></tr><tr><td>Roller Mixer SRT9D</td><td>Sturt</td><td>SRT9D</td><td></td></tr><tr><td>Histology Cassettes</td><td>Medizintechnik</td><td>81-0021-00</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Strile Surgical Blade&amp;nbsp;</td><td>Aesculap</td><td>BB536&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Aesculap</td><td>BB084R</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Aesculap</td><td>BD047R</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Aesculap</td><td>BC374R</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin base mold</td><td>SAKURA</td><td>4166</td><td></td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix</td><td>Thermoscientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic/Antimycotic</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F/12</td><td>Life Technologies</td><td>11039-021</td><td>Prewarm (37 &amp;deg;C)</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Roche</td><td>11 088 793 001</td><td>Prewarm (37 &amp;deg;C)</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10270</td><td>Can be replaced with Fetal Calf Serum</td></tr><tr><td>Cell Blood Lysis Buffer</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Roth</td><td>335</td><td></td></tr><tr><td>Isopentane</td><td>Sigma</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>1009831000</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic vials (5.0 ml)</td><td>VWR, International</td><td>479-0820</td><td></td></tr><tr><td>Ultra low attachment culture dish</td><td>Corning, NY 14831</td><td>3471</td><td></td></tr></tbody></table>

an ex vivo model to study hormone action in the human breast

ヒト乳癌におけるホルモン作用の研究は、適切なモデル系の欠如によって妨げられてきた。 インビトロ培養の際に、一次乳房上皮細胞は、ホルモン受容体の発現を失う傾向がある。広く使用され、ホルモン受容体陽性乳癌細胞株は、in vivoの状況に限定関連のものである。ここでは、ヒト乳癌におけるホルモン作用を研究するためのex vivoモデルを記述。このような還元mammoplastiesまたはmammectomiesなどの外科廃棄材料からの新鮮なヒト乳房組織標本は、機械的および酵素的に管と小葉及び複数間質細胞タイプを含む組織断片を得るために消化される。これらの組織の微細構造は、それらの間の接触を維持する成長因子を含まない基礎培地中で組織構造を保持し、数日間のホルモン応答性のままである。それらは容易にRNAおよびタンパク質抽出、組織学的分析のために処理または凍結培地中に保存されている。蛍光活性化セルソーティング（FACS）は、特定の細胞集団を濃縮するために使用することができる。このプロトコルは、非常に複雑、多様なヒト検体との翻訳研究のための簡単​​な、標準的なアプローチを提供します。

エストロゲンとプロゲステロンの役割を研究するために、より良いヒト乳癌におけるそれらの分子の機能を理解するために、我々は彼らのインフォームドコンセントを得た後に、還元mammoplasties（ 図1）を受けた患者から新鮮なヒト乳房組織標本を収集します。また、手術時の血清プロゲステロンのレベルを決定するために、患者の医学的および出産歴、ならびに血液サンプルを?...

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An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

私たちは、ヒト乳癌におけるホルモン作用を研究するための新規のex vivoモデルを開発した。これは、組織構造、細胞間相互作用、およびパラクリンシグナル伝達を維持する外科乳房組織標本から単離された組織の微細構造に基づいている。

アン<em&gt;エクスビボ</emヒト乳癌でホルモンの作用を研究するために&gt;モデル

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

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An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

11.3K ビュー.  Ecole polytechnique fédérale de Lausanne. 私たちは、ヒト乳癌におけるホルモン作用を研究するための新規のex vivoモデルを開発した。これは、組織構造、細胞間相互作用、およびパラクリンシグナル伝達を維持する外科乳房組織標本から単離された組織の微細構造に基づいている。 

ビデオ: An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, xenografts, genetic manipulation, chemical reagents induction, etc.) have various pathological characters and play important roles in investigating certain aspects of diseases. Although no single model can totally mimic the whole human disease progression, orthotopic organs disease models with a proper stromal environment play an irreplaceable role in understanding diseases and screening for potential drugs. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and follow the metastasis to distant organs. With the proper features of primary tumor growth, breast and nipple pathological changes, and a high occurrence of other organs&#39; metastasis, this model maximumly mimics human breast cancer progression. Primary tumor growth in situ, long-distant metastasis, and the tumor microenvironment of breast cancer can be investigated by using this model.

Here, we present a protocol to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and this mouse orthotopic breast cancer model with a proper mammary fat pad environment can be used to investigate various aspects of cancer.

マウス乳腺の脂肪パッドに乳癌細胞の同所性同種注入

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

がん研究

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. Immortalized cell lines are easy to grow and genetically modify to study molecular mechanisms, yet the selective pressure from cell culture often leads to genetic and epigenetic alterations over time. Patient-derived xenograft (PDX) models faithfully recapitulate the heterogeneity and drug response of human breast tumors. PDX models exhibit a relatively short latency after orthotopic transplantation that facilitates the investigation of breast tumor biology and drug response. The transplantable genetically engineered mouse models allow the study of breast tumor immunity. The current protocol describes the method to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad followed by drug treatments. These preclinical models provide valuable approaches to investigate breast tumor biology, drug response, biomarker discovery and mechanisms of drug resistance.

Patient-derived xenograft (PDX) models and transplantable genetically engineered mouse models faithfully recapitulate human disease and are preferred models for basic and translational breast cancer research. Here, a method is described to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad to study tumor biology and evaluate drug response.

乳癌の前臨床モデルとしての乳房腫瘍の移植性

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

細胞および組織サンプルからのヒト乳がん幹細胞の単離と機能評価

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs fail clinical trials. Therefore, new models are needed to improve our understanding of the disease. The NIH Microphysiological Systems (MPS) program was developed to improve the clinical translation of basic science discoveries and promising new therapeutic strategies. Here we present a method for generating MPS for breast cancers (BC-MPS). This model adapts a previously described approach of culturing primary human white adipose tissue (WAT) by sandwiching WAT between adipose-derived stem cell sheets (ASC)s. Novel aspects of our BC-MPS include seeding BC cells into non-diseased human breast tissue (HBT) containing native extracellular matrix, mature adipocytes, resident fibroblasts, and immune cells; and sandwiching the BC-HBT admixture between HBT-derived ASC sheets. The resulting BC-MPS is stable in culture ex vivo for at least 14 days. This model system contains multiple elements of the microenvironment that influence BC including adipocytes, stromal cells, immune cells, and the extracellular matrix. Thus BC-MPS can be used to study the interactions between BC and its microenvironment. 
We demonstrate the advantages of our BC-MPS by studying two BC behaviors known to influence cancer progression and metastasis: 1) BC motility and 2) BC-HBT metabolic crosstalk. While BC motility has previously been demonstrated using intravital imaging, BC-MPS allows for high-resolution time-lapse imaging using fluorescence microscopy over several days. Furthermore, while metabolic crosstalk was previously demonstrated using BC cells and murine pre-adipocytes differentiated into immature adipocytes, our BC-MPS model is the first system to demonstrate this crosstalk between primary human mammary adipocytes and BC cells in vitro.

This protocol describes the construction of an in vitro microphysiological system for studying breast cancer using primary human breast tissue with off the shelf materials.

微小生理学的システムを用いたヒト乳房組織における乳癌のモデル化

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical outcomes. Preclinical mouse models of breast cancer brain metastatic (BCBM) growth are useful but are expensive, and it is difficult to track live cells and tumor cell invasion within the brain parenchyma. Presented here is a protocol for ex vivo brain slice cultures from xenografted mice containing intracranially injected breast cancer brain-seeking clonal sublines. MDA-MB-231BR luciferase tagged cells were injected intracranially into the brains of Nu/Nu female mice, and following tumor formation, the brains were isolated, sliced, and cultured ex vivo. The tumor slices were imaged to identify tumor cells expressing luciferase and monitor their proliferation and invasion in the brain parenchyma for up to 10 days. Further, the protocol describes the use of time-lapse microscopy to image the growth and invasive behavior of the tumor cells following treatment with ionizing radiation or chemotherapy. The response of tumor cells to treatments can be visualized by live-imaging microscopy, measuring bioluminescence intensity, and performing histology on the brain slice containing BCBM cells. Thus, this ex vivo slice model may be a useful platform for rapid testing of novel therapeutic agents alone or in combination with radiation to identify drugs personalized to target an individual patient&#39;s breast cancer brain metastatic growth within the brain microenvironment.

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

We introduce a protocol for measuring real-time drug and radiation response of breast cancer brain metastatic cells in an organotypic brain slice model. The methods provide a quantitative assay to investigate the therapeutic effects of various treatments on brain metastases from breast cancer in an ex vivo manner within the brain microenvironment interface.

乳がん脳転移性腫瘍増殖を研究し、標的とする Ex Vivo 脳スライスモデル

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its progression. Although the mechanisms involved in promoting breast cancer growth have been intensively studied using monocultures of breast cancer cells such as MCF-7 cells, the contribution of other cell types, such as vascular and lymphatic endothelial cells that are intimately involved in tumor growth, has not been investigated in depth. Cell-cell interaction plays a key role in tumor growth and progression. Neoangiogenesis, or the development of vessels, is essential for tumor growth, whereas the lymphatic system serves as a portal for cancer cell migration and subsequent metastasis. Recent studies provide evidence that vascular and lymphatic endothelial cells can significantly influence cancer cell growth. These observations imply a need for developing in vitro models that would more realistically reflect breast cancer growth processes in vivo. Moreover, restrictions in animal research require the development of ex vivo models to elucidate better the mechanisms involved.
This article describes the development of breast cancer spheroids composed of both breast cancer cells (estrogen receptor-positive MCF-7 cells) and vascular and/or lymphatic endothelial cells. The protocol describes a detailed step-by-step approach in creating dual-cell spheroids using two different approaches, hanging drop (gold standard and cheap) and 96-well U-bottom plates (expensive). In-depth instructions are provided for how to delicately pick up the formed spheroids to monitor growth by microscopic sizing and assessing viability using dead and live cell staining. Moreover, procedures to fix the spheroids for sectioning and staining with growth-specific antibodies to differentiate growth patterns in spheroids are delineated. Additionally, details for preparing spheroids with transfected cells and methods to extract RNA for molecular analysis are provided. In conclusion, this article provides in-depth instructions for preparing multi-cell spheroids for breast cancer research.

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Crosstalk between mammary epithelial cells and endothelial cells importantly contributes to breast cancer progression, tumor growth, and metastasis. In this study, spheroids have been made from breast cancer cells together with vascular and/or lymphatic endothelial cells and demonstrate their applicability as an in vitro system for breast cancer research.

乳がん研究のための潜在的機能 インビトロ モデルとしての乳腺上皮および内皮細胞スフェロイド

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is limited to cell proliferation and gene expression endpoints. However, in the organism, mammary morphogenesis occurs in a 3D environment. 3D culture systems help bridge the gap between monolayer cell culture (2D) and the complexity of the organism. Herein, we describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action. It uses the commercially available hormone-responsive human breast epithelial cell line, T47D, and rat tail collagen type 1 as a matrix. This 3D culture model responds to the main mammotropic hormones: estradiol, progestins and prolactin. The influence of these hormones on epithelial morphogenesis can be observed after 1- or 2-week treatment according to the endpoint. The 3D cultures can be harvested for analysis of epithelial morphogenesis, cell proliferation and gene expression.

We describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action.

ヒト乳腺上皮のホルモン応答性の3D培養モデル

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

生物工学

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

腫瘍増殖を研究するためにマウスの乳房脂肪パッド中に乳癌細胞の同所注入。

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

医学

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both direct and rapid analysis of therapeutic sensitivity and resistance. However, recent evidence suggests that therapeutic response is not exclusive to the inherent molecular composition of cancer cells but rather is greatly influenced by the tumor cell microenvironment, a feature that cannot be recapitulated by traditional culturing methods. Even implementation of tumor xenografts, though providing a wealth of information on drug delivery/efficacy, cannot capture the tumor cell/microenvironment crosstalk (i.e., soluble factors) that occurs within human tumors and greatly impacts tumor response. To this extent, we have developed an ex vivo (fresh tissue sectioning) technique which allows for the direct assessment of treatment response for preclinical and clinical therapeutics development. This technique maintains tissue integrity and cellular architecture within the tumor cell/microenvironment context throughout treatment response providing a more precise means to assess drug efficacy.

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

Established cancer cell lines and xenografts have been the mainstay of cancer research for the past several decades. However, recent evidence suggests that therapeutic response is greatly influenced by the tumor cell microenvironment. Therefore, we have developed an ex vivo analysis of primary tumor specimens for drug development purposes.

エキソビボ処理前臨床のための原発腫瘍および/ ​​または関連した転移の応答と治療薬の臨床開発

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both ...

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little is known about breast cancer cell properties and behaviors within the native microenvironment of human bone tissue.We have developed approaches to track, quantify and modulate human breast cancer cells within the microenvironment of cultured human bone tissue fragments isolated from discarded femoral heads following total hip replacement surgeries. Using breast cancer cells engineered for luciferase and enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression, we are able to reproducibly quantitate migration and proliferation patterns using bioluminescence imaging (BLI), track cell interactions within the bone fragments using fluorescence microscopy, and evaluate breast cells after colonization with flow cytometry. The key advantages of this model include: 1) a native, architecturally intact tissue microenvironment that includes relevant human cell types, and 2) direct access to the microenvironment, which facilitates rapid quantitative and qualitative monitoring and perturbation of breast and bone cell properties, behaviors and interactions. A primary limitation, at present, is the finite viability of the tissue fragments, which confines the window of study to short-term culture. Applications of the model system include studying the basic biology of&#160;breast cancer and other bone-seeking malignancies within the metastatic niche, and developing therapeutic strategies to effectively target breast cancer cells in bone tissues.

Protocols are described for studying breast cancer cell migration, proliferation and colonization in a human bone tissue explant model system.

培養ヒト大腿骨組織外植するための方法は、転移性ニッチの乳癌細胞コロニー形成を研究する

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

アン

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乳癌の前臨床モデルとしての乳房腫瘍の移植性

細胞および組織サンプルからのヒト乳がん幹細胞の単離と機能評価

微小生理学的システムを用いたヒト乳房組織における乳癌のモデル化

乳がん脳転移性腫瘍増殖を研究し、標的とする Ex Vivo 脳スライスモデル

乳がん研究のための潜在的機能インビトロモデルとしての乳腺上皮および内皮細胞スフェロイド

ヒト乳腺上皮のホルモン応答性の3D培養モデル

腫瘍増殖を研究するためにマウスの乳房脂肪パッド中に乳癌細胞の同所注入。

エキソビボ処理前臨床のための原発腫瘍および/ または関連した転移の応答と治療薬の臨床開発

培養ヒト大腿骨組織外植するための方法は、転移性ニッチの乳癌細胞コロニー形成を研究する

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乳癌の前臨床モデルとしての乳房腫瘍の移植性

細胞および組織サンプルからのヒト乳がん幹細胞の単離と機能評価

微小生理学的システムを用いたヒト乳房組織における乳癌のモデル化

乳がん脳転移性腫瘍増殖を研究し、標的とする Ex Vivo 脳スライスモデル

乳がん研究のための潜在的機能 インビトロ モデルとしての乳腺上皮および内皮細胞スフェロイド

ヒト乳腺上皮のホルモン応答性の3D培養モデル

腫瘍増殖を研究するためにマウスの乳房脂肪パッド中に乳癌細胞の同所注入。

エキソビボ処理前臨床のための原発腫瘍および/ ​​または関連した転移の応答と治療薬の臨床開発

培養ヒト大腿骨組織外植するための方法は、転移性ニッチの乳癌細胞コロニー形成を研究する

乳がん研究のための潜在的機能インビトロモデルとしての乳腺上皮および内皮細胞スフェロイド

エキソビボ処理前臨床のための原発腫瘍および/ または関連した転移の応答と治療薬の臨床開発