著者は、乳房形成の写真を提供するためのローザンヌ大学病院のM.マイクロフィッシュ、M.ワース·実験癌研究のためのスイスの研究所のA. Ayyanan、研究分子腫瘍、生命科学の学校、エコール連邦工科·デ·コンピテンスのナショナルセンターに感謝批判的なコメントのためにマンチェスター大学の技術支援のためのローザンヌとR·クラーク。これらの結果につながる研究なしグラント契約の下でSNF3100A0-112090、Oncosuisse 531817、および革新的な医薬品イニシアティブ共同事業の支援を受けている。 115188、現物出資における製薬産業と協会の企業の欧州連合の第7次フレームワークプログラム（FP7 / 2007年から2013年）と欧州連合からの財政貢献」で構成されているの資源。革新的な医薬品イニシアティブのWebアドレスです<a href="http://www.imi.europa.eu/" target="_blank">http://www.imi.europa.eu/</a> 。&lt;/ pの&gt;

一般的な考慮事項：前もって、倫理プロトコルを設定するには、患者のためのアンケートを作成し、臨床的な人材の育成に参照してください。削減乳房形成手術から材料を使用する前に、権限を調達し、患者の同意を確保する。組織は、感染し、それに応じて処理する必要があります。実験的癌研究スイス研究所 - このプロトコルはISRECの倫理委員会によって承認された。 1.組織の回復、加工、バイオバンキングバイオバンキングのための最適なサンプルの品質を確保するために、ステップの数は、実験室に輸送する前に病院で行われる。 病院で： <ol><li>必要であれば、縮小乳房形成術および血液試料から無菌条件下で、ヒト乳房組織を得る。組織は、悪性病変の存在を除外するサンプリングする病理学者によって検査される必要がある。 </li><li>胸tを置きます無菌のボード上のボンネットの下に発行し、はさみ、外科用メス、すでに蒸気滅菌器で滅菌されたピンセットを準備します。それを開くためにメスを用いて乳房組織の異なる部位で深いカットを行います。黄色の脂肪組織中に埋め込まれている管および小葉からなる白色ストランド、ヒトの乳房組織の外観である。 注：黄色の脂肪組織に白の実質の比率は、女性の間で異なっている。一般的に若い女性がより多くの上皮組織を持っている。 </li><li>その後はさみで脂肪組織から優しくそれらを分離、白い材料片を選び、鉗子でそれらを保持する。血管を取ることは避けてください。 </li><li>血液を除去するためにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）pHが7.2で組織片をリンスする。と1％のAN（5000単位/ mlのペニシリンおよび5000グラム/ mlのストレプトマイシンを含む）2％ペニシリン/ストレプトマイシンとフェノールレッドを含まないF12培地（ダルベッコ改変イーグル培地F12）を含む250ミリリットルのペットボトルに組織を転送tibiotic /アンホテリシンBは、（10,000単位/ mlのペニシリン、ストレプトマイシン10,000 / mlの、およびアムホテリシンB25μg/ mlを含む）。研究室への輸送のための媒体で保管して組織。 </li><li>冷たい（ドライアイス）イソペンタンでクライオバイアルでそれらを凍結するRNAとタンパク質の抽出およびフラッシュ用の直径5mm - 3の部分を準備します。研究室への輸送のためにドライアイスボックスに転送する。 </li><li>金型には5mmと最適切削温度（OCT）の層でそれをカバーして、冷たいイソペンタンで満たされた箱の平らな底に金型を配置 - 3のピースを置く。完全な凍結後にドライアイスボックスに金型を転送する。 </li><li>ホルムアルデヒド中でパラホルムアルデヒドで直径5mm（PFA）4％と、他の5個（FA）後でRT組織学的分析では、PBS中4％ - 3の5作品を修正する。いくつかの抗体は、より良い1つまたは2つの相互に働くように、2つの異なる固定剤を推奨します。 </li></ol>研究室では： <ol start="8"><li>やる、削減乳房形成に関するすべての情報をcument手術日とサンプルが右乳房対左から派生しているかどうか。 </li><li> -80℃で凍結サンプルを配置し、固定の2時間後に組織学カセットに固定した組織を移す。その後、4℃でO / N保存のために、PBS中70％エタノールのいずれかに置く。翌日、パラフィン包埋のため組織学施設に組織学カセットを転送する。 </li></ol> 2.組織消化とホルモン刺激<ol><li> P2の細胞培養室で層流キャビネットに組織サンプルを含むボトルに移す。無菌のまな板（29×19 cm）の上の組織片を置きます。鉗子で材料を保持し、メスで離れて乳房実質（白い部分）から残りの脂肪と血管をこすり。 10cmの培養皿にPBSに白色物質を配置します。 </li><li>すべての部分からの脂肪物質を除去し、安全性の規則に従って、それらを配置した後研究室のSは、バックチョッピングボード上の上皮組織を含む白色パーツを配置。対向するメスを使用して、組織を切断し、最大直径2mmの断片に切る。 </li><li>適切なサイズのチューブにみじん切り素材を配置：1、2.5及び10ミリリットルまでを5、15または50ミリリットルチューブに、それぞれ。典型的には、5 mlチューブ利回り十分なパラフィン埋め込みやホルモンの刺激のための材料、および蛍光活性化細胞のための15ミリリットルチューブ利回り十分な材料選別（FACS）。より大きなチューブは分量を凍結するために使用されている。 </li><li> 1％ペニシリン/ストレプトマイシン/アンホテリシンBおよびコラゲナーゼA（ ヒストリチクス菌からClostridiopeptidase A）と培地からなる消化マスターミックス（フェノールレッドなしのDMEM / F12）を準備します。消化時間に応じてコラゲナーゼ線量。 <ol><li> 12、24、インキュベーションの36時間、1.5 mg / mlで、1.0 mg / mlのおよび0.5mg / mlのそれぞれのコラゲナーゼの最終濃度を使用する。の4倍に消化マスターミックスを加える消化された材料の量は、十分な攪拌と通気を確保する。 注：実験計画とホルモン刺激の継続期間に応じて、中または酵素消化工程および微細構造回復後のいずれかのホルモンを追加します。 </li></ol></li><li>サンプルおよびコントロールの車両をテストするために所望の濃度でホルモン（複数可）を追加する。 17-βエストラジオール、及びプロメゲストン（R​​5020）による刺激のために20nmの最終濃度を使用しています。 NOTE：R5020培地中の天然プロゲステロンよりも安定である合成プロゲステロン受容体アゴニストである。 <ol><li> 37℃のインキュベーターと40 rpmでO / N内部のローラーミキサー上に置きチューブ。ミキサーでサンプルを配置する前に、すべての物質が遠心管に沿って分散していることを確実にするために非常によく再懸濁します。 </li></ol></li><li>消化は12未満の時間のホルモン刺激の回で少なくとも12時間（O / N）をとるように、（微細構造の回復の後にホルモンを追加するデステップ3の下につかれた）。あなたは微細構造を再懸濁し、超低付着プレートにサスペンションを置くようにホルモンを追加します。組織の微細構造は、約70％の生存率を維持する成長因子を含まない培地中で7日間までの超低付着プレートに保つことができる。 </li><li> RNAおよびタンパク質分析のために、遠心分離管中で5分間フラッシュ凍結、400×gで遠心分離することによって、組織の微細構造を集める。 </li></ol>組織微細構造の3回復<ol><li> 5分間400×gでチューブ（単数または複数）を遠心する。遠心管の上部から脂肪を吸引し、5分間1250×gで新しい遠心チューブと遠心分離機に、線維芽細胞が濃縮され、残った水性上清、上清を移す。 注：以降のすべてのステップが軽くチューブを攪拌することによってペレットを再懸濁するために乳房組織の微細構造は、非常に粘着性であるので。ピペッティングは、材料を失うリスクにはお勧めしません。 </lI&gt; <li>微細構造およびPBS、2％ウシ胎児血清（FCS）、水性上清由来の線維芽細胞に富むペレットを再懸濁する。その後5分間1250×gで両方の管を回転した後、上清を捨てる。 </li><li> 3にペレットを再懸濁 - 5mlの赤血球血液溶解緩衝液チューブを洗浄するためにそれらを転送する。室温で5分間のためにそれらをインキュベートします。 </li><li> PBS、2％FCSの2倍のボリュームを追加し、5分間1250×gで、それらを遠心する。 5分間1250×gでPBS、2％FCSおよび遠心機でペレットを洗ってください。二回、この手順を繰り返します。 </li></ol>フローサイトメトリー用4.サンプル<ol><li>ペレットに0.25％トリプシン2ミリリットル、細胞を解離するために千μlのピペットマンで2分間非常に優しく上下にピペッティングすることによって、それをミックスして - 1を追加します。 </li><li> 9ミリリットルPBS、2％FCSを添加することにより、トリプシン活性を阻害する。 5分間450×gで遠心分離し、10mlのPBS、2％FCS中でペレットを再懸濁。 </li><li>トンに置か40μmのセルストレーナー上に細胞懸濁液を転送単一の細胞を調製するための50mlの遠心分離管のオペアンプ。細胞懸濁液を数マイクロリットルのフィルターの上部に残っている場合、それらは、ピペットでストレーナの反対側からそれらを吸引することにより、フィルタを通過し、濾過した微細構造に追加助ける。 </li><li>その後、別個の免疫細胞、抗CD45のカクテルを微細構造からの線維芽細胞および内皮細胞、抗FAPおよび抗CD31抗体とは、それぞれ、10管腔、基底細胞を分離するための汎上皮マーカーのEpCAMおよびCD10に基づいて、FACSで並べ替える。 </li></ol>組織学のために5.サンプル<ol><li>上記のように機械的および酵素的に消化された物質を洗浄した後、室温で30分間PBS中の4％PFAを1mlの1.5ミリリットル初期材料からペレットを固定する。 </li><li> 5分間1250×gで遠心分離し、および1で洗浄する - 二回2mlのPBS。 </li><li> 10分間16000×gで遠心分離する。この間、トリス - 酢酸-EDTA（1％多目的アガロースを準備TAE）の緩衝液溶液が沸騰になるまで電子レンジで溶液を加熱する。 <ol><li>電子レンジから溶液を除去し、溶液を混合し、残りのアガロース粒子を再懸濁させ軽くフラスコを旋回。 50℃に冷却し、アガロース溶液及びパラフィンベースモールド1mlのを注ぐ31×23×13.5ミリメートルの大きさ。 </li></ol></li><li>上清を捨て、固化層の上にペレットを配置 - フラットエンドとのへらを用いてアガロースの（1〜3ミリ）。アガロースの追加層（40℃）でそれらすべてをカバーしています。 </li><li>アガロースが固化した後、通常は5分以内で、パラフィン埋め込みのための組織学カセットにアガロースブ​​ロックを配置。サンプルは、鉛筆の小さな文字で書かれた削減乳房形成数、実験条件、および日付に関するすべての情報をカセットに白い事務用紙を置き、アガロースとともに。この書き込みは、以降のすべての処理工程に耐える。 </li><li>にカセットを入れてPBS O / N、または4℃で週末の保存のために70％エタノール中。我々は2つ​​のストレージ·ソリューションとの間に何の違いも気づいていない。そして、パラフィン包埋のために組織学施設に組織学カセットを転送する。 </li></ol> 6.凍結微細構造（今後の培養） <ol><li> 10％のジメチルスルホキシド（DMSO）にFCSからなるとクライオバイアル内の1mLのアリコートを凍結する凍結培地中に再懸濁し、組織の微細構造。得られたクライオバイアルの数が削減乳房形成から得られた一次材料の量に依存します。 </li><li>以下のプログラムを用いて制御された速度の冷凍庫を使用して、組織の微細構造を含むクライオバイアルを凍結：5分でC -12℃に温度を下げ、6℃/分の速度で-7℃の温度を下げ、4℃で住居6℃/分、10分住居の速度、6℃/分の速度で-40℃まで温度を下げて-80℃に温度を下げる6℃/分の速度。その後、Cの冷凍庫-80℃に凍結バイアルを転送します。 </li><li>翌日、長期保存のために液体窒素タンクに-80℃からクライオバイアルを移す。 </li></ol>

<ol>
	<li>Beral, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+and+hormone-replacement+therapy+in+the+Million+Women+Study.">Breast cancer and hormone-replacement therapy in the Million Women Study.</a> Lancet. 362 (9382), 419-427 (2003).</li><li>MacMahon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+at+first+birth+and+breast+cancer+risk.">Age at first birth and breast cancer risk.</a> Bull World Health Organ. 43 (2), 209-221 (1970).</li><li>Pike, M. C., Krailo, M. D., Henderson, B. E., Casagrande, J. T., Hoel, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Hormonal'+risk+factors,+'breast+tissue+age'+and+the+age-incidence+of+breast+cancer.">'Hormonal' risk factors, 'breast tissue age' and the age-incidence of breast cancer.</a> Nature. 303 (5920), 767-770 (1983).</li><li>Brisken, C., O'Malley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone+action+in+the+mammary+gland.">Hormone action in the mammary gland.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (12), a003178 (2011).</li><li>Levenson, A. S., Jordan, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCF-7:+the+first+hormone-responsive+breast+cancer+cell+line.">MCF-7: the first hormone-responsive breast cancer cell line.</a> Cancer Res. 57 (15), 3071-3078 (1997).</li><li>Tanos, T., Rojo, L. 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著者らは、開示することは何もない。

ここで説明するのex vivo培養は、通常、ヒト女性の胸肉で見つかった他の細胞型と一緒に、完全な管および小葉を含む乳房 ​​組織の微細構造を提供しています。ヒト乳房組織の処理では、通常の還元mammoplasties、脂肪組織の除去、間質マトリックスの機械的および酵素的消化から得られ、そして赤血球の溶解は、乳管フラグメントおよび端子乳管小葉単位富化。右の存続期間のための?...

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Marie Shamseddin
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Marie Shamsheddin

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Erratum: An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

乳癌における突然変異景観に関する情報は、急速に増加している。以下の注意は、乳癌の発達に影響を与える全身性因子が注目されている。生殖ホルモンへの曝露は、疾患の進行1-3に大きな影響を与えます。しかし、生殖ホルモンはヒト乳房に衝突するメカニズムはよく理解されていない。遺伝子操作したマウスモデルとの仕事は、彼らがいくつかの下流エフェクター4を介して細胞内因性および傍分泌に関与することを明らかにした。 ヒト乳癌におけるホルモン作用についての限られた知識は、適切なモデルの欠如に主に起因している。エストロゲン受容体（ER）およびプロゲステロン受容体（PR）のシグナル伝達のメカニズムのほとんどの作業は、MCF-7およびT47Dなどのホルモン受容体陽性乳癌細胞株を用いて行われた。これらはalreaいた進行乳癌患者からの胸膜滲出液由来したDYは、複数の治療法5を受け取った。ヒト乳房のような単純なin vitroモデルにおける知見の生物学的関連性は、これらのin vitroモデルで識別さ疑わしいとターゲット遺伝子である動物モデル6で識別された標的遺伝子とは異なります。初代ヒト乳房上皮細胞は、インビトロで培養される場合、それらは、ホルモン受容体の発現、したがって、ホルモン応答7,8を失う傾向がある。この問題は、マトリゲルを使用して洗練された3Dアプローチによってcircumventdすることができます。このように、C·クラークらは、ホルモン受容体の発現を維持し、プロゲステロン刺激9に対する増殖応答を示した乳房上皮細胞を樹立することに成功した。しかし、 生体内プロゲステロン受容体標的遺伝子において重要な二つのWnt-4、RANKL、このシステム9プロゲステロン刺激により誘導されなかった。このアプローチは、最近、 インビトロでさらに上に撮影された</em&gt;のホルモン治療前とRANKL誘導は10を達成した。注意点は、マトリゲルはバッチに依存している活動があることに変わりは高価であり、わずかな細胞数のためになりやすい実験計画を要求する。 インビボでの ERおよびPRシグナル伝達に主としてパラクリン相互作用11によって媒介されるという知見に基づいて、我々は、細胞間相互作用が維持される必要があると主張した。組織は、インビトロ培養のために単一細胞に解離されると失われたもう一つの重要な要因は、細胞外マトリックスと上皮細胞との相互作用である。まだこれらは、上皮分化のために重要であり、その破壊は、腫瘍形成において重要である12。これを念頭において、私たちは新鮮な外科廃棄材13から乳房組織の微細構造を分離する方法を確立した。インナー腔側と外側myoepitheliで二層上皮からなる乳房実質、らの細胞は、脂肪組織から離れて切開し、機械的および酵素的解離に供される。洗浄および遠心分離後、乳管の断片は、多くの間質​​細胞との密接な相互作用を維持することが求​​められる。これらの組織の微細構造は、ホルモン応答残る。モデルは、臨床検体13に検証されました。このように、本手順では、生物学的および臨床的に関連する文脈において乳癌におけるホルモン作用を研究するために助けることができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="877">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:164px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:260px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:335px;">Microlitre Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:164px;">Heraeus Biofuge Fresco</td>
			<td style="width:119px;">75005521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Centrifuge 5810R</td>
			<td style="width:164px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5810 000.327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Cryobox</td>
			<td style="width:164px;">Nalgene&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;">5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:335px;">Controlled Rate Freezer EF600 Grant</td>
			<td style="width:164px;">Asymptote&#160;</td>
			<td style="width:119px;">EF600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:164px;">Hera Cell Heraeus</td>
			<td style="width:119px;">51022391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Roller Mixer SRT9D</td>
			<td style="width:164px;">Sturt</td>
			<td style="width:119px;">SRT9D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Histology Cassettes</td>
			<td style="width:164px;">Medizintechnik</td>
			<td style="width:119px;">81-0021-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Cell Strainer</td>
			<td style="width:164px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Strile Surgical Blade&#160;</td>
			<td style="width:164px;">Aesculap</td>
			<td>BB536&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Scalpel</td>
			<td style="width:164px;">Aesculap</td>
			<td style="width:119px;">BB084R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Forceps</td>
			<td style="width:164px;">Aesculap</td>
			<td style="width:119px;">BD047R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Scissors</td>
			<td style="width:164px;">Aesculap</td>
			<td style="width:119px;">BC374R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Paraffin base mold</td>
			<td style="width:164px;">SAKURA</td>
			<td style="width:119px;">4166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix</td>
			<td style="width:164px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:119px;">6769006</td>
			<td style="width:260px;">Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Antibiotic/Antimycotic</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">DMEM F/12</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td>11039-021</td>
			<td>Prewarm (37&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Collagenase</td>
			<td style="width:164px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11 088 793 001</td>
			<td>Prewarm (37&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10270</td>
			<td>Can be replaced with Fetal Calf Serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Cell Blood Lysis Buffer</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Agarose</td>
			<td style="width:164px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F1635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:164px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Isopentane</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M32631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Ethanol</td>
			<td style="width:164px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1009831000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Cryogenic vials (5.0ml)&#160;</td>
			<td style="width:164px;">VWR, International</td>
			<td style="width:119px;">479-0820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Ultra low attachment culture dish</td>
			<td style="width:164px;">Corning, NY 14831</td>
			<td style="width:119px;">3471</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo model to study hormone action in the human breast

ヒト乳癌におけるホルモン作用の研究は、適切なモデル系の欠如によって妨げられてきた。 インビトロ培養の際に、一次乳房上皮細胞は、ホルモン受容体の発現を失う傾向がある。広く使用され、ホルモン受容体陽性乳癌細胞株は、in vivoの状況に限定関連のものである。ここでは、ヒト乳癌におけるホルモン作用を研究するためのex vivoモデルを記述。このような還元mammoplastiesまたはmammectomiesなどの外科廃棄材料からの新鮮なヒト乳房組織標本は、機械的および酵素的に管と小葉及び複数間質細胞タイプを含む組織断片を得るために消化される。これらの組織の微細構造は、それらの間の接触を維持する成長因子を含まない基礎培地中で組織構造を保持し、数日間のホルモン応答性のままである。それらは容易にRNAおよびタンパク質抽出、組織学的分析のために処理または凍結培地中に保存されている。蛍光活性化セルソーティング（FACS）は、特定の細胞集団を濃縮するために使用することができる。このプロトコルは、非常に複雑、多様なヒト検体との翻訳研究のための簡単​​な、標準的なアプローチを提供します。

エストロゲンとプロゲステロンの役割を研究するために、より良いヒト乳癌におけるそれらの分子の機能を理解するために、我々は彼らのインフォームドコンセントを得た後に、還元mammoplasties（ 図1）を受けた患者から新鮮なヒト乳房組織標本を収集します。また、手術時の血清プロゲステロンのレベルを決定するために、患者の医学的および出産歴、ならびに血液サンプルを?...

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An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

私たちは、ヒト乳癌におけるホルモン作用を研究するための新規のex vivoモデルを開発した。これは、組織構造、細胞間相互作用、およびパラクリンシグナル伝達を維持する外科乳房組織標本から単離された組織の微細構造に基づいている。

アン<em&gt;エクスビボ</emヒト乳癌でホルモンの作用を研究するために&gt;モデル

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

11.3K ビュー.  Ecole polytechnique fédérale de Lausanne. 私たちは、ヒト乳癌におけるホルモン作用を研究するための新規のex vivoモデルを開発した。これは、組織構造、細胞間相互作用、およびパラクリンシグナル伝達を維持する外科乳房組織標本から単離された組織の微細構造に基づいている。 

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Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

PTSDの、ニューラル血液学的および行動的相関関係を明らかにするための動物モデルにおけるバイオマーカー

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

医学

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

人間の神経内分泌腫瘍療法の研究のための三次元モデルとしての人間の神経内分泌腫瘍細胞株

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic lesions. Mouse models are an important tool to investigate inflammatory processes in atherogenesis, but these models suffer from the phenotypic and functional differences between the murine and human immune system. In vitro cell experiments are used to specifically evaluate cell type-dependent changes caused by a substance of interest, but culture-dependent variations and the inability to analyze the influence of specific molecules in the context of the inflammatory compound in atherosclerotic lesions limit the impact of the results. In addition, measuring levels of a molecule of interest in human blood helps to further investigate its clinical relevance, but this represents systemic and not local inflammation. Therefore, we here describe a plaque culture model to study human atherosclerotic lesion biology ex vivo. In short, fresh plaques are obtained from patients undergoing endarterectomy or coronary artery bypass grafting and stored in RPMI medium on ice until usage. The specimens are cut into small pieces followed by random distribution into a 48-well plate, containing RPMI medium in addition to a substance of interest such as cytokines or chemokines alone or in combination for defined periods of time. After incubation, the plaque pieces can be shock frozen for mRNA isolation, embedded in Paraffin or OCT for immunohistochemistry staining or smashed and lysed for western blotting. Furthermore, cells may be isolated from the plaque for flow cytometry analysis. In addition, supernatants can be collected for protein measurement by ELISA. In conclusion, the presented ex vivo model opens the possibility to further study inflammatory lesional biology, which may result in identification of novel disease mechanisms and therapeutic targets.

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process. This manuscript illustrates an easy to use ex vivo model to investigate fresh carotid or coronary artery plaques. The ex vivo model allows for the investigation of potential substances on the inflammatory milieu in human atherosclerotic lesions and results can be analyzed by various methods.

ヒューマン<em&gt;生体外</em&gt;動脈硬化性プラークのモデルは、病変生物学を研究する

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

脳Microslicesの興奮毒性刺激<em&gt;インビトロ</em&gt;脳卒中のモデル

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells. 
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first &#8220;organ&#8221; culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Dupuytren&#8217;s disease (DD) is a fibroproliferative disease of the palm of the hand. Here, we present a protocol to culture resection specimens from DD in a three-dimensional (3D) culture system. Such short-term culture system allows preservation of the 3D structure and molecular properties of the fibrotic tissue.

人間デュピュイトラン<em&gt;エクスビボ</em筋線維芽細胞と細胞外マトリックス相互作用の研究のために&gt;文化

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little is known about breast cancer cell properties and behaviors within the native microenvironment of human bone tissue.We have developed approaches to track, quantify and modulate human breast cancer cells within the microenvironment of cultured human bone tissue fragments isolated from discarded femoral heads following total hip replacement surgeries. Using breast cancer cells engineered for luciferase and enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression, we are able to reproducibly quantitate migration and proliferation patterns using bioluminescence imaging (BLI), track cell interactions within the bone fragments using fluorescence microscopy, and evaluate breast cells after colonization with flow cytometry. The key advantages of this model include: 1) a native, architecturally intact tissue microenvironment that includes relevant human cell types, and 2) direct access to the microenvironment, which facilitates rapid quantitative and qualitative monitoring and perturbation of breast and bone cell properties, behaviors and interactions. A primary limitation, at present, is the finite viability of the tissue fragments, which confines the window of study to short-term culture. Applications of the model system include studying the basic biology of&#160;breast cancer and other bone-seeking malignancies within the metastatic niche, and developing therapeutic strategies to effectively target breast cancer cells in bone tissues.

Protocols are described for studying breast cancer cell migration, proliferation and colonization in a human bone tissue explant model system.

培養ヒト大腿骨組織外植するための方法は、転移性ニッチの乳癌細胞コロニー形成を研究する

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

生体内および生体外では腹膜脂肪にミルキースポット構造の卵巣がん転移性コロニー形成を研究するためのアプローチで

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

ヒト腫瘍異種移植片からマウス細胞の枯渇は大幅に標的細胞の下流分析を向上させます

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to establish human enteroid ex vivo culture systems are important to model intestinal pathophysiology and to study the particular cellular responses involved. In recent years, enteroids from mice and humans are being cultured, passaged, and banked away for future use in several laboratories across the world. This enteroid platform can be used to test the effects of various treatments and drugs and what effects are exerted on different cell types in the intestine. Here, a protocol for establishing primary stem cell-derived small intestinal enteroids derived from neonatal mice and premature human intestine is provided. Moreover, this enteroid culture system was utilized to test the effects of species-specific breast milk. Mouse breast milk can be obtained efficiently using a modified human breast pump and expressed mouse milk can then be used for further research experiments. We now demonstrate the effects of expressed mouse, human, and donor breast milk on the growth and proliferation of enteroids derived from neonatal mice or premature human small intestine.

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

This protocol describes how to establish an enteroid culture system from neonatal mouse or premature human intestine as well as an efficient method to collect milk from mice.

母乳 Enteroids の増殖を促進する: 細胞増殖のEx Vivoモデル

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

ワイヤー図法を使用してマウスの腸間膜動脈の等尺性収縮力測定

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...