LISCAと呼ばれる単一細胞アレイのライブセルイメージングは、何百もの個々の細胞の蛍光時間コースの自動読み出しでもあります。このアプローチの利点は、個々の細胞応答が同一のマイクロ環境で空間的に単離された細胞から記録され、優れた統計を用いた効率的な発光分析が可能になる点である。単一セル配列を製造するには、メスを使用して、6つのマイクロパウダーストライプを含む単一のPDM傑作をPDM層から切り取り、マイクロパターンを上に向けてラボベンチに置きます。
カミソリの刃を使用して、6つのマイクロパターンストライプをそれぞれPDMスタンプに切り取り、パターン化された領域の一部を切り取り、スタンプの端が開くようにします。次に、6つのチャンバースライドのカバースリップの保護箔を注意深く傷つけてスライドのチャネル位置をマークし、保護ホイルを下に向けてベンチにカバースリップを置きます。ピンセットを使用して、マークされたチャンネル位置のカバースリップにスタンプを置き、マイクロパターンを下に向けて、顕微鏡下でスタンプの取り付けを確認します。
スライドに接する正方形は、スペースよりも暗く表示されます。パターンの品質は、スライドに正しくアタッチされていない四角形によって低下します。スタンプがしっかりと取り付けられている場合は、カバースリップと酸素プラズマを持つスタンプを0.2ミリバールで、約40ワットで3分間処理して、PDMスタンプとカバースリップ親水性の間の表面を作ります。
プラズマクリーニングの最後に、カバースリップをバイオセーフティキャビネットに入れ、各スタンプに15マイクロリットルのペグ化ポリリジン溶液を加え、溶液がスタンプの親水性パターンに吸収されるようにします。20分後、1ミリリットルの超純水で切手をすすきます。ピンセットを使用してスライドから切手を取り除き、2ミリリットルの超純水でカバースリップを2回目にすすります。
カバースリップが完全に乾燥したら、マイクロパターン化された領域がチャネルの下部に合うように注意して、カバースリップに6チャンネル粘着スライドを取り付けます。そして、各チャネルにPBSの40マイクロリットルとフィブロネクチン溶液の40マイクロリットルを追加します。2つの溶液を混合するには、1つのリザーバから40マイクロリットルを取り出し、同じチャネルの反対側の貯水池に3回加え、均質な溶液を生成します。
すべてのチャネルが混合されたら、各チャネルを洗浄ごとに120マイクロリットルのPBSで3回洗浄する前に、室温でスライドを45分間インキュベートします。PBSを摂氏37度に交換し、120マイクロリットルの培地を1つの貯水池に加えてチャネル中の細胞増殖培地を完全に補い、反対側の貯水池から取り除きます。400,000細胞の40マイクロリットルを対象の懸濁液及び40マイクロリットルの細胞増殖培地を各チャネルに加え、示したように培地と細胞溶液を混合する。
混合後、各チャンネルから40マイクロリットルの懸濁液を取り除き、チャネルのみを細胞懸濁液で満たして、スライドを細胞培養インキュベーターに入れる。1時間後、位相差顕微鏡で細胞接着を確認し、各チャネルに摂氏37度の120マイクロリットルを加え、さらに3時間スライドを細胞培養インキュベーターに戻す。灌流システムをセットアップするには、摂氏37度の細胞成長培地で満たされた1ミリリットルのシリンジをシステムの入口チューブに接続し、バルブを使用してチューブを媒体で満たします。
入口管を1つのチャネルの貯留槽に接続し、気泡が閉じ込められなくて注意し、現在のチャネルの入口管と反対のリザーバにシリアルコネクタを接続します。必要な数のチャンネルが連続して接続されるまで、示されているように残りのチャンネルを接続します。そして、出口管を最終的なチャネルの自由な貯蔵所に直接接続する。
次に、接続されたチューブを媒体で満たし、灌流システムが漏れないことを確認します。細胞のタイムラプスイメージングのために、位相コントラスト画像と蛍光画像を記録するためのタイムラプスプロトコルを設定し、位相コントラストイメージングおよび蛍光イメージング用の光学構成を設定する。10倍の目標、適切な蛍光フィルター、自動フォーカス補正システムを使用して、長期的な測定のためのより良い画質を保証します。
位相コントラスト画像の10ミリ秒の露光時間と、EGFP蛍光強度を記録するための750ミリ秒の露光時間を選択します。位置リストを通る連続したループと30時間の観測時間の間の10分の時間間隔で、時間スケジュールを設定します。次に、マイクロスコープの37°Cの加熱室のサンプルホルダーに、単一のセラー上げに6つのチャネルスライドを置き、ステージに灌流システムチューブをテープします。
出口管の自由端を15ミリリットルの円錐形チューブに挿入して、液体廃棄物を収集します。スキャン時間経過測定の位置リストを設定し、ポジションリストを通して連続ループ間の定義された時間間隔内で、位置数をスキャンすることができるように注意する。次に、タイムラプス測定を開始します。
蛍光マーカーを用いた細胞のトランスフェクションでは、注射器を使用して、37°C PBSの1ミリリットルでチューブシステムを洗い流し、顕微鏡ステージが動かないように注意してください。フラッシュ後、対象のmRNAを補充した血清還元培地300マイクロリットルを、マイクロリットル当たり0.5ナノグラムのmRNAの最終濃度に満たし、リポプレックスが1時間インキュベートできるようにします。インキュベーションの終了時に、摂氏37度の完全な細胞増殖培地の1ミリリットルでシステムを洗い流し、任意の非結合mRNAを除去する。
分析の最後に、チャンネルメニューにリストされているチャンネルを表示し、時間枠をスクロールして、事前に選択された細胞とその統合蛍光信号を検査します。目的のセルをクリックして蛍光時間の経過時間をハイライト表示するか、タイムコースをクリックして対応するセルを見つけます。Shift キーを押しながらセルをクリックすると、選択または選択解除できます。
生存できない、または接着点に限定されていない、または別のセルに結合されている細胞を選択解除して、さらなる分析から除外します。すべての細胞が適切に選択または選択解除されたら、細胞領域の単一の細胞時間コースと統合蛍光を適切なディレクトリに保存します。トランスフェクション後の翻訳導入時間、および細胞EGFP発現の強度を定量化するために、3段階の翻訳モデルを採用することができる。
EGFPのモデルソリューションは、図のように単一セルタイムコースに適合させることができます。ここで、翻訳導入時間のヒストグラムとリポプレックストランスフェクト細胞の発現率が観察できる。両方のパラメータが各細胞について推定されるように、これらのパラメータの相関は、散布図で示されるように分析することができ、脂質ナノ粒子をトランスフェクトした細胞と比較することができます。
図示したように、脂質ナノ粒子を導入した細胞は、リポプレックスをトランスフェクトした細胞と比較して細胞間変動性が低い。そして、母平均は、翻訳の発症が速く、より高い発現率を示しています。当社のアプローチは、代替のマイクロパターニング方法にも適応することができます。
LISCAにとって最も重要なのは、良好な細胞閉じ込めと、便利なユーザーの監督を伴う自動画像分析の組み合わせです。あなたが見てきたように、細胞の挙動は異質です。そして、単一細胞のタイムラプス映画は、固有の生化学的ネットワークの公平なダイナミクスへのアクセスを提供します。
例えば、緑色発現では、アポトーシスまたは細胞殺死アッセイが挙がる。
