照射されたバフィーコートからのフィーダー細胞を用いたTリンパ球の分離と培養による大動脈弁石灰化の調査

このプロトコルは簡単に実行できます。クローニングフェーズでは、より多くのTクローンを新鮮なサンプルから得ることができます。また、T細胞の表現型や機能は容易に解析できる。

手順を実証することは、私の研究室の博士課程の学生、メアリー・クリストファーです。T細胞クローニングを誘導するには、針のないバルブでバッグスパイクを使用して、ラミナーフローフードに照射されたバフィーコートバッグを開きます。袋から最大50ミリリットルの血液をT-150フラスコに移し、70ミリリットルのPBSをフラスコに加えます。

希釈した血液の30ミリリットルを4つの50ミリリットル円錐形チューブのそれぞれで20ミリリットルの密度勾配に慎重に重ね、密度勾配遠心分離によって細胞を分離する。上清を慎重に吸引し、PBMCを各チューブから単一の新しい50ミリリットルチューブに移します。PBSを使用して最終容積を50ミリリットルにし、遠心分離によってPBMCを収集します。

同じ条件で2回目の洗浄を行った後、単離されたフィーダー細胞を計数用の細胞培養培地10ミリリットルにサスペンドし、50単位のIL-2溶液を2本の50ミリリットルチューブのそれぞれに加えて70ミリリットルの細胞培養培地に25ミリリットルを加える。次に、2%10で1つのチューブにフィーダー細胞を加え、IL-2濃度で補った細胞培地の6ミリリットル当たりの細胞に10番目の細胞を添加する。Tリンパ球培養をセットアップするには、ステノティックバルブサンプルフラスコの上清を含むT細胞クローンを1本の50ミリリットルチューブにプールし、遠心分離によって細胞を回収する。

ペレットを1回のPBS50ミリリットルで3回洗浄し、細胞を1ミリリットルの細胞培養培地で再懸濁させて計数する。細胞を1ミリリットル当たり3番目の細胞に10個に希釈し、フィーダー細胞なしでIL-2を添加した細胞培養培地のチューブに500マイクロリットルの細胞を加える。フィーダーセル懸濁液をプラスチック100、15ミリリットルのペトリ皿に加え、実験に適当な数のU-底96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルのフィーダーセルを追加します。

その後、ペトリ皿にT細胞を加え、各フィーダー細胞に100マイクロリットルのT細胞を加え、細胞培養インキュベーターで1週間インキュベートを十分に補った。PBMCの単離は、フィーダー細胞を得るために不可欠であり、大動脈弁サンプル中の浸潤性白血球の検出と特性評価を可能にします。2週間のインキュベーションの後、クローンT細胞集団が得られる。

ここで、石灰性大動脈弁疾患患者におけるT細胞亜集団を分析するための格子化スキームが示されている。この患者で観察されたように、CD8+T細胞よりも多くのCD4+T細胞があった。未クローンT細胞のフローサイトメトリクス分析は、同じT細胞マーカーがネイティブバルブとクローンサンプルの両方に存在することを確認します。

これらのデータをまとめて、これらのデータは、Cd45+白血球を有する石灰化大動脈弁にT細胞が存在することを示し、石灰化大動脈弁疾患が免疫系の活性化および炎症活性と関連していることを示唆している。この方法は非常に汎用性があります。これは、研究者が組織から細胞を分離する必要があるさまざまなプロトコルに適用することができます, 機能的特性評価のために.

汚染を避けるために無菌条件下で働き、顕微鏡下で細胞を批判的に観察することが重要であることを覚えておいてください。