חקירת הסתיידות שסתום אבי העורקים באמצעות בידוד ותרבות של לימפוציטים T באמצעות תאי מאכיל ממעיל באפי מוקרן

קל לבצע פרוטוקול זה. שלב השיבוט מאפשר לקבל מספר גדול יותר של שיבוטי T מדגימות טריות. יתר על כן, פנוטיפ ותפקוד של תאי T ניתן לנתח בקלות.

תוכיח את ההליך תהיה מרי כריסטופר, דוקטורנט מהמעבדה שלי. כדי לגרום לשיבוט תאי T, השתמש בספייק השקית עם השסתום נטול המחטים כדי לפתוח שקית מעיל באפי מוקרן במכסה המנוע של זרם למינאר. מעבירים עד 50 מיליליטר של דם מהתיק לתוך בקבוקון T-150, ומוסיפים 70 מיליליטר של PBS לבקבוקון.

שכבה בזהירות 30 מיליליטר של הדם מדולל על 20 מיליליטר של שיפוע צפיפות בכל אחד מארבעה צינורות חרוט 50 מיליליטר, ולהפריד את התאים על ידי צנטריפוגה הדרגתית צפיפות. בזהירות לשאוף supernatant, ולהעביר את PBMC מכל צינור לתוך צינור 50 מיליליטר חדש אחד. השתמש PBS כדי להביא את הנפח הסופי ל 50 מיליליטר ולאסוף את PBMC על ידי צנטריפוגה.

לאחר שטיפה שנייה באותם תנאים, להשעות את תאי המאכיל המבודדים ב 10 מיליליטר של מדיום תרבית התא לספירה, ולהוסיף 25 מיליליטר של מדיום תרבית תאים 70 מיליליטר בתוספת 50 יחידות של פתרון IL-2 לתוך כל אחד משני צינורות 50 מיליליטר. לאחר מכן להוסיף תאי מאכיל לצינור אחד ב 2 על 10 כדי 6 תאים למיליליטר של תרבית התא בינוני בתוספת עם ריכוז IL-2. כדי להגדיר תרבית לימפוציטים T, לאגד את שיבוט תא T המכיל supernatants מבקבוק דגימת שסתום שסטוטית לתוך צינור יחיד 50 מיליליטר, ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה.

לשטוף את הכדור שלוש פעמים ב 50 מיליליטר של PBS לכל לשטוף, לפני שימוש חוזר את התאים 1 מיליליטר של מדיום תרבית התא לספירה. לדלל את התאים ל 1 על 10 כדי 3 תאים למיליליטר ריכוז, ולהוסיף 500 microliters של תאים לצינור של תרבית התא מדיום בתוספת IL-2 ללא תאי מאכיל. מוסיפים את ההשעיה של תא המאכיל לצלחת פטרי מפלסטיק 100 על 15 מיליליטר, ומוסיפים 100 מיקרוליטרים של תאי מאכיל לכל באר של המספר המתאים של לוחות 96-באר תחתונים U לניסוי.

לאחר מכן הוסיפו את תאי ה-T לצלחת פטרי, והוסיפו 100 מיקרוליטרים של תאי T לכל תא מאכיל בתוספת טובה לדגירה של שבוע באינקובטור תרבית התאים. בידוד PBMC חיוני להשגת תאי מאכילה ולאפשר זיהוי ואפיון של לויקוציטים חודרים בדגימות שסתום אבי העורקים. לאחר שבועיים של דגירה, ניתן להשיג אוכלוסיית תאי T משובטים.

כאן, תוכנית gating לניתוח תת-אוכלוסין של תאי T בחולים עם מחלת שסתום אבי העורקים קלציפי מוצג. כפי שנצפה בחולה זה, היו יותר תאי CD4 + T מאשר CD8 + תאי T. ניתוח ציטומטרי זרימה של תאי T unloned מאשר כי אותם סמני תא T נמצאים הן שסתום מקורי דגימות שיבוט.

יחד, נתונים אלה מצביעים על כך שתאי T נמצאים שסתומי אבי העורקים מסוידים עם CD45 + לויקוציטים, דבר המצביע על כך מחלת שסתום אבי העורקים קלציפי קשורה עם הפעלת המערכת החיסונית ופעילות דלקתית. שיטה זו היא מאוד תכליתית. זה יכול להיות מיושם על פרוטוקולים שונים אשר החוקר צריך להיות מסוגל לבודד תאים מרקמה, עבור האפיון התפקודי.

זכור כי חשוב לעבוד בתנאים סטריליים כדי למנוע זיהום, כדי לצפות באופן ביקורתי את התאים מתחת למיקרוסקופ.