Este protocolo é fácil de executar. A fase de clonagem permite que um número maior de clones T seja obtido a partir de amostras frescas. Além disso, o fenótipo e a função das células T podem ser facilmente analisados.
Demonstrando o procedimento estará Mary Christopher, uma estudante de doutorado do meu laboratório. Para induzir a clonagem de células T, use o espeto do saco com a válvula livre de agulha para abrir um saco de casaco de buffy irradiado em uma capa de fluxo laminar. Transfira até 50 mililitros de sangue do saco para um frasco T-150, e adicione 70 mililitros de PBS ao frasco.
Cuidadosamente camada 30 mililitros do sangue diluído em 20 mililitros de gradiente de densidade em cada um dos quatro tubos cônicos de 50 mililitros, e separar as células por centrifugação gradiente de densidade. Aspire cuidadosamente o supernasal e transfira o PBMC de cada tubo para um único tubo de 50 mililitros. Use o PBS para levar o volume final a 50 mililitros e coletar o PBMC por centrifugação.
Após uma segunda lavagem sob as mesmas condições, suspenda as células alimentadores isoladas em 10 mililitros de cultura celular para contagem, e adicione 25 mililitros de um meio de cultura celular de 70 mililitros complementado com 50 unidades de solução IL-2 em cada um dos dois tubos de 50 mililitros. Em seguida, adicione células alimentadoras a um tubo a 2 por 10 a 6ª células por mililitro de cultura celular complementada com concentração de IL-2. Para configurar uma cultura de linfócitos T, junte o clone de células T contendo supernantes da amostra de válvula estenótica em um único tubo de 50 mililitros, e colete as células por centrifugação.
Lave a pelota três vezes em 50 mililitros de PBS por lavagem, antes de reutilizar as células em 1 mililitro de meio de cultura celular para contar. Diluir as células a uma 1 por 10 a 3ª células por concentração de mililitro, e adicionar 500 microlitres de células ao tubo de cultura celular meio suplementado com IL-2 sem células alimentadores. Adicione a suspensão da célula alimentadora a uma placa de plástico 100 por 15 mililitros de Petri, e adicione 100 microliters de células alimentadoras a cada poço do número apropriado de placas de 96 poços para o experimento.
Em seguida, adicione as células T a uma placa de Petri, e adicione 100 microliters de células T a cada célula alimentadora complementada bem para uma incubação de uma semana na incubadora de cultura celular. O isolamento do PBMC é vital para a obtenção de células alimentadoras e para permitir a detecção e caracterização de leucócitos infiltrados em amostras de válvulas aórticas. Após duas semanas de incubação, uma população de células T clones pode ser obtida.
Aqui, mostra-se o esquema de gating para análise de subpopulações de células T em pacientes com doença da válvula aórtica calcificada. Como observado neste paciente, havia mais células CD4+T do que células CD8+T. A análise citométrica de fluxo de células T nãocloadas confirma que os mesmos marcadores de células T estão presentes em amostras nativas de válvulas e clones.
Juntos, esses dados indicam que as células T estão presentes em válvulas aórticas calcificadas com CD45+leucócitos, sugerindo que a doença da válvula aórtica calcifica está ligada à ativação do sistema imunológico e à atividade inflamatória. Este método é muito versátil. Pode ser aplicado a diferentes protocolos para os quais o pesquisador precisa ser capaz de isolar células de um tecido, para a caracterização funcional.
Tenha em mente que é importante trabalhar em condições estéreis para evitar contaminação, e observar criticamente as células sob o microscópio.
