Este protocolo es fácil de realizar. La fase de clonación permite obtener un mayor número de clones T a partir de muestras frescas. Además, el fenotipo y la función de las células T se pueden analizar fácilmente.
Demostrando el procedimiento estará Mary Christopher, una estudiante de doctorado de mi laboratorio. Para inducir la clonación de células T, use la espiga de la bolsa con la válvula sin aguja para abrir una bolsa de capa de buffy irradiada en una campana de flujo laminar. Transfiera hasta 50 mililitros de sangre de la bolsa a un matraz T-150 y agregue 70 mililitros de PBS al matraz.
Coloque cuidadosamente 30 mililitros de la sangre diluida en 20 mililitros de gradiente de densidad en cada uno de los cuatro tubos cónicos de 50 mililitros, y separe las células mediante centrifugación por gradiente de densidad. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y transfiera el PBMC de cada tubo a un solo tubo nuevo de 50 mililitros. Utilice PBS para llevar el volumen final a 50 mililitros y recoger el PBMC por centrifugación.
Después de un segundo lavado en las mismas condiciones, suspenda las células alimentadoras aisladas en 10 mililitros de medio de cultivo celular para contar, y agregue 25 mililitros de un medio de cultivo celular de 70 mililitros complementado con 50 unidades de solución de IL-2 en cada uno de los dos tubos de 50 mililitros. Luego agregue células alimentadoras a un tubo a una 2 por 10 a las 6ª células por mililitro de medio de cultivo celular complementado con concentración de IL-2. Para establecer un cultivo de linfocitos T, agrupe el clon de células T que contiene sobrenadantes del matraz de muestra de válvula estenótica en un solo tubo de 50 mililitros y recoja las células por centrifugación.
Lave el pellet tres veces en 50 mililitros de PBS por lavado, antes de volver a suspender las células en 1 mililitro de medio de cultivo celular para contar. Diluya las células a una concentración de 1 por 10 a la 3ª célula por mililitro, y agregue 500 microlitros de células al tubo de medio de cultivo celular suplementado con IL-2 sin células alimentadoras. Agregue la suspensión de la célula alimentadora a una placa de Petri de plástico de 100 por 15 mililitros, y agregue 100 microlitros de células alimentadoras a cada pozo del número apropiado de placas de 96 pocillos con fondo en U para el experimento.
Luego agregue las células T a una placa de Petri y agregue 100 microlitros de células T a cada célula alimentadora complementada bien durante una incubación de una semana en la incubadora de cultivo celular. El aislamiento de PBMC es vital para obtener células alimentadoras y permitir la detección y caracterización de leucocitos infiltrantes en muestras de válvula aórtica. Después de dos semanas de incubación, se puede obtener una población de células T clonadas.
Aquí, se muestra el esquema de gating para analizar las subpoblaciones de células T en pacientes con enfermedad de la válvula aórtica calcificada. Como se observó en este paciente, había más células T CD4 + que células T CD8 + . El análisis citométrico de flujo de células T no clonadas confirma que los mismos marcadores de células T están presentes tanto en muestras de válvulas nativas como de clones.
Tomados en conjunto, estos datos indican que las células T están presentes en las válvulas aórticas calcificadas con leucocitos CD45 +, lo que sugiere que la enfermedad de la válvula aórtica calcificada está relacionada con la activación del sistema inmunológico y la actividad inflamatoria. Este método es muy versátil. Se puede aplicar a diferentes protocolos para los cuales el investigador necesita poder aislar células de un tejido, para la caracterización funcional.
Tenga en cuenta que es importante trabajar en condiciones estériles para evitar la contaminación y observar críticamente las células bajo el microscopio.
