Bu protokolün gerçekleştirilmesi kolaydır. Klonlama aşaması, taze örneklerden daha fazla sayıda T klonu elde edilmesine izin verir. Ayrıca, T hücrelerinin fenotipi ve işlevi kolayca analiz edilebilir.
Prosedürü gösteren mary Christopher olacak, laboratuvarımdan bir doktora öğrencisi. T hücreli klonlamayı teşvik etmek için, laminer akış davlumbazında ışınlanmış buffy palto çantasını açmak için iğnesiz valfli torba çivisini kullanın. Torbadan 50 mililitreye kadar kanı bir T-150 şişesine aktarın ve şişeye 70 mililitre PBS ekleyin.
Seyreltilmiş kanın 30 mililitresini dört 50 mililitre konik tüpün her birinde 20 mililitre yoğunluk gradyanı üzerine dikkatlice katlayın ve hücreleri yoğunluk gradyan santrifüjleme ile ayırın. Süpernatantı dikkatlice emiş edin ve PBMC'yi her tüpten tek bir yeni 50 mililitre tüpe aktarın. Son hacmi 50 mililitreye çıkarmak ve PBMC'yi santrifüjleme ile toplamak için PBS'yi kullanın.
Aynı koşullar altında ikinci bir yıkamadan sonra, izole edilmiş besleyici hücrelerini sayım için 10 mililitre hücre kültürü ortamında askıya alın ve iki 50 mililitre tüpün her birine 50 birim IL-2 çözeltisi ile desteklenmiş 70 mililitrelik bir hücre kültürü ortamının 25 mililitresini ekleyin. Daha sonra IL-2 konsantrasyonu ile desteklenmiş hücre kültürü ortamının mililitre başına 6. Bir T lenfosit kültürü kurmak için, stenotik kapak örnek şişesinden süpernatantlar içeren T hücre klonunu tek bir 50 mililitrelik tüpe bir araya toplayın ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın.
Hücreleri saymak için 1 mililitre hücre kültürü ortamında canlandırmadan önce, peleti yıkama başına 50 mililitre PBS'de üç kez yıkayın. Hücreleri mililitre konsantrasyonu başına 1'e 10 ila 3. Besleyici hücre süspansiyonunu plastik bir 100'e 15 mililitre Petri kabına ekleyin ve deney için uygun sayıda U-bottom 96 kuyu plakasının her kuyusuna 100 mikrolitre besleyici hücresi ekleyin.
Daha sonra T hücrelerini bir Petri kabına ekleyin ve hücre kültürü inkübatörde bir hafta boyunca iyi desteklenmiş her besleyici hücreye 100 mikrolitre T hücresi ekleyin. PBMC izolasyonu, besleyici hücrelerin elde edilmesi ve aort kapak örneklerinde lökositlerin sızmasının tespiti ve karakterizasyonu için hayati öneme sahiptir. İki haftalık inkübasyondan sonra, bir klon T hücre popülasyonu elde edilebilir.
Burada kalsfik aort kapak hastalığı olan hastalarda T hücreli subpopulasyonların analizi için gating şeması gösterilmiştir. Bu hastada da gözlendiği gibi CD8+T hücrelerinden daha fazla CD4+T hücresi vardı. Kavunlanmamış T hücrelerinin akış sitometrik analizi, hem doğal valf hem de klon örneklerinde aynı T hücre işaretleyicilerinin bulunduğunu doğrular.
Birlikte ele alındığında, bu veriler T hücrelerinin CD45 + lökositli kireçlenmiş aort kapaklarında bulunduğunu göstermektedir, bu da kalsfiik aort kapak hastalığının bağışıklık sisteminin aktivasyonu ve enflamatuar aktivite ile bağlantılı olduğunu göstermektedir. Bu yöntem çok yönlüdür. Fonksiyonel karakterizasyon için araştırmacının bir dokudan hücreleri izole edebilmesi gereken farklı protokollere uygulanabilir.
Kirlenmeyi önlemek için steril koşullar altında çalışmanın ve mikroskop altındaki hücreleri eleştirel bir şekilde gözlemlemenin önemli olduğunu unutmayın.
