オルガノイド由来の単層は、患者の腸上皮バリア機能を再現し、各患者の機能障害を増強することを目的とした治療法の効果を試験して、パーソナライズされた治療戦略を特定することを可能にする。オルガノイド単層は、損傷が起こる側である上皮の頂端側へのアクセスを提供し、3D構造として成長するオルガノイドにおいて正常でアクセス可能である。すべてのオルガノイドは異なるため、闘争です。
タイトな単層を形成するには、増殖期にオルガノイドを使用し、迅速に消化して2〜4個の細胞のクラスターを形成する。すべてのモデルについて細胞播種を滴定する。手順のデモンストレーションは、HUBのシニアリサーチアソシエイトであるWies Van Dooremalenによって行われます。
膜挿入物を細胞外マトリックスまたはECMでコーティングすることから始める。バイオセーフティキャビネットで作業し、メンブレンインサートを支持プレートに入れます。ECM 40Xを氷冷DPBS中でカルシウムおよびマグネシウムで希釈し、次いで、希釈ECMの150マイクロリットルを各インサートの頂端区画にピペットする。
プレートを摂氏37度で少なくとも1時間インキュベートする。播種用の細胞を準備するには、細胞解離試薬のアリコートを摂氏37度の水浴中で予備温める。6ウェルプレートの各ウェルに2ミリリットルの試薬を使用する。
オルガノイドを含む培養プレートをインキュベーターからバイオセーフティキャビネットに移す。テキスト原稿に記載されているようにオルガノイドを処理しますが、複数のチューブを1つのチューブにプールしないでください。オルガノイドを回収した後、基礎培地またはBMを12ミリリットルに加え、85倍Gで遠心分離し、上清を吸引する。
オルガノイドを含むチューブを最大12ミリリットルのDPBSで満たし、次に10ミリリットルのピペットを使用してピペットを10回上下させます。Gを85回で8°Cで5分間遠心分離し、オルガノイドペレットを乱すことなく上清を吸引する。予め加温した細胞解離試薬をオルガノイドに加え、それらを再懸濁し、次いで、チューブを37°Cの水浴中で斜めまたは水平に5分間インキュベートする。
インキュベーション後、5ミリリットルの滅菌プラスチックピペットまたはP1000ピペットを用いてピペットを10回上下させる。顕微鏡下でオルガノイド懸濁液をチェックして、単一細胞と2〜4個の細胞からなるいくつかの細胞凝集塊の混合物が形成されたかどうかを確認する。ROCK阻害剤を細胞懸濁液に最大12ミリリットルのBMを添加することによって細胞解離を止める。
細胞を遠心分離し、次いで細胞ペレットを乱すことなく上清を吸引する。同じオルガノイド培養物を複数のチューブで処理する場合は、細胞ペレットをプールしてから、12ミリリットルのBMに再懸濁してください。BMで予め濡れた40マイクロメートルのストレーナーを通して細胞懸濁液をろ過し、フロースルーを50ミリリットルの円錐形チューブに収穫し、次いでストレーナーを10ミリリットルのBMで洗浄し、フロースルーを同じチューブに収穫する。緊張した細胞懸濁液を2つの新しい15ミリリットルの円錐管に移し、遠心分離を繰り返す。
細胞ペレットを乱すことなく上清を吸引し、出発物質として使用した完全培養プレートあたり10マイクロモルのROCK阻害剤を添加した4ミリリットルのIEMに細胞を再懸濁する。少量の細胞懸濁液をトリパンブルーと1対1の比率で混合してカウントし、細胞をカウントし、生細胞の総数を計算し、個々のセルを小さな凝集塊でカウントします。IEMの6ミリリットル当たり10~10マイクロモルのROCK阻害剤を添加した6番目の生細胞を含む細胞懸濁液を調製する。
細胞を播種するには、ECMコーティングされたインサートからDPBSを慎重に吸引し、プレートを水平に保ちます。各側底区画にROCK阻害剤を添加したIEMのピペット800マイクロリットルと、頂端区画内のECMコーティング膜上に調製した細胞懸濁液150マイクロリットルを滴下する。プレートを摂氏37度と二酸化炭素5%のインキュベーターに入れます。
細胞が膜上に沈降したら、経上皮電気抵抗またはTEERを毎日測定し、顕微鏡を使用して膜挿入物を画像化する。単層をリフレッシュするには、膜インサートを含むプレートの側底区画から培地を除去し、次いで、頂端区画から培地を注意深く吸引する。150マイクロリットルの新鮮なIEMを各頂端コンパートメントに滴下し、800マイクロリットルの新鮮なIEMを各側方コンパートメントに加える。
手動TEERメーターを使用する場合は、電極を70%エタノールで洗浄し、バイオセーフティキャビネット内で空気乾燥させてから、電極をBMを含むチューブに入れます。電極を手動TEERメーターに接続し、オーム単位で測定する機能スイッチを回し、電源スイッチをオンにします。短い電極をインサートの頂端室に配置し、長い電極を単分子層に触れることなく側方区画に配置します。ブランクウェルの抵抗を測定し、次に残りのサンプルで抵抗を測定します。
異なる条件のサンプル間で電極をBMで洗浄する。終了したら、デミ水と70%エタノールで電極をきれいにしてから、風乾させます。このプロトコールは、腸管オルガノイドを採取し、上皮細胞の単層を調製するために使用された。
IEMで8日間培養した単層をここに示す。単層を腸球分化培地またはEDMに曝露すると構造が観察され、一方、単層を併用培地またはCDMに曝露すると、より滑らかな構造を示す。単層形成は、TEERを測定することによって定量的に続いた。
完全にコンフルエントな単分子膜は、約100オームセンチメートル平方のTEER値を有し、これはいずれかの分化培地に曝露されたときに増加した。全ての培地条件において単層は、ルシファーイエローに対するより低い見かけの透過性を示した。IEMで培養した回腸単層によるリゾチーム分泌は、EDMまたはCDMでコンフルエントになるまでおよびさらに4日間、IEMで培養した単層よりも高かった。
IEM、IEMおよびそれに続くEDM、またはIEMおよびそれに続くCDMで培養された単層は、H&E、Ki67、MUC2、およびAlcian Blue染色で観察された形態に違いを示す。分化すると、増殖性細胞は減少し、杯細胞および腸球マーカー遺伝子発現は、LGR5、MUC2、およびアルカリホスファターゼ遺伝子発現によって示されるようにIEM条件下で観察されたものと比較して増加した。単層を調製する場合、それらを消化した後にオルガノイドのアノイキスを防止することが重要です。
さらに、細胞内のECMはトランスウェル膜上に均等に分布すべきである。オルガノイド由来の単分子膜は、患者固有の方法で異なる蛍光基質を使用して分子輸送を評価することを可能にする。
