מונו-שכבות שמקורן באורגנואידים משחזרות את תפקוד מחסום אפיתל המעיים של המטופל ומאפשרות לבחון את ההשפעה של טיפולים שמטרתם לשפר את תפקוד לקוי אצל כל מטופל כדי לזהות אסטרטגיות טיפול מותאמות אישית. מונו-שכבות אורגנואידיות מספקות גישה לצד האפיקלי של האפיתל, שהוא הצד שבו מתרחש הנזק, והוא תקין ונגיש באורגנואידים הגדלים כמבנים תלת-ממדיים. כל אורגנואיד הוא שונה, ומכאן המאבק.
כדי ליצור מונו-שכבות הדוקות, השתמשו באורגנואידים בשלב ההתפשטות והתעכלו במהירות כדי ליצור אשכולות של שניים עד ארבעה תאים. תגרמו את זריעת התאים לכל דגם. הדגמת ההליך תיעשה על ידי וייס ואן דורמלן, עמית מחקר בכיר ב-HUB.
התחילו בציפוי תוספות ממברנה עם מטריצה חוץ-תאית או ECM. בעבודה בארון בטיחות ביולוגית, מניחים את הממברנה מכניסים לתוך לוח התמיכה. דיללו את ה-ECM 40X ב-DPBS קר כקרח עם סידן ומגנזיום, ואז פיפטה 150 מיקרוליטרים של ה-ECM המדולל לתוך התא האפיקלי של כל תוסף.
הדגירה של הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות. כדי להכין את התאים לזריעה, יש לחמם מראש ריאגנט דיסוציאציה של תאים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. השתמש בשני מיליליטרים של המגיב עבור כל באר של צלחת שש בארות.
העבירו את צלחת התרבית המכילה את האורגנואידים מהאינקובטור לארון הבטיחות הביולוגית. מעבדים את האורגנואידים כמתואר בכתב היד של הטקסט, אך אינם מקבצים צינורות מרובים לצינור אחד. לאחר קצירת האורגנואידים, מוסיפים את המדיום הבסיסי או BM ל-12 מיליליטרים וצנטריפוגה ב-85 פעמים G, ואז שואפים לסופרנאטנט.
מלאו את הצינור המכיל את האורגנואידים בעד 12 מיליליטרים של DPBS, ואז פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים באמצעות פיפטה של 10 מיליליטר. צנטריפוגה ב 85 פעמים G במשך חמש דקות בשמונה מעלות צלזיוס ולשאוף את supernatant מבלי להפריע לכדור האורגנואידי. מוסיפים את מגיב דיסוציאציית התאים המחומם מראש לארגנואידים ומחזרים אותם, ואז מדגרים את הצינורות באלכסון או אופקית במשך חמש דקות באמבט המים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
לאחר הדגירה, פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים באמצעות פיפטה פלסטיק סטרילית של חמישה מיליליטר או פיפטה P1000. בדוק את ההשעיה האורגנואידית מתחת למיקרוסקופ כדי לראות אם נוצרה תערובת של תאים בודדים וכמה גושי תאים המורכבים משניים עד ארבעה תאים. עצרו את דיסוציאציית התאים על ידי הוספת עד 12 מיליליטרים של BM עם מעכב ROCK לתרחיף התא.
צנטריפוגה על התאים, ואז לשאוף את הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדור התא. כאשר מטפלים באותה תרבית אורגנואידית במספר צינורות, יש לאסוף את כדורי התאים לפני השימוש החוזר בהם ב-12 מיליליטרים של BM. מסננים את תרחיף התא דרך מסננת של 40 מיקרומטר שהורטבה מראש עם BM וקוצרים את הזרימה-דרך לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר, ואז שוטפים את המסננת עם 10 מיליליטרים של BM וקוצרים את הזרימה-דרך לאותו צינור. מעבירים את תרחיף התאים המתוח לשני צינורות חרוטיים חדשים של 15 מיליליטר וחוזרים על הצנטריפוגה.
לשאוף את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור התא ולהחיות את התאים בארבעה מיליליטרים של IEM בתוספת מעכב ROCK של 10 מיקרומולר לכל צלחת תרבית מלאה המשמשת כחומר התחלה. ערבבו כמות קטנה של תרחיף תאים ביחס של אחד לאחד עם Tripan Blue לספירה, ואז ספרו את התאים וחשבו את המספר הכולל של תאים חיים, תוך ספירת כל תא בודד בגושים קטנים. הכן תרחיף תא המכיל 3X 10 עד השישי תאים חיים למיליליטר של IEM בתוספת מעכב ROCK 10 מיקרומולרי.
כדי לזרוע את התאים, שאפו בזהירות ל-DPBS מהתוספות מצופות ה-ECM, תוך שמירה על הצלחת אופקית. פיפט 800 מיקרוליטרים של IEM בתוספת מעכב ROCK לכל תא בזולטרלי ו-150 מיקרוליטרים של תרחיף התא שהוכנו על הממברנה המצופה ECM בתא האפיקלי. מניחים את הצלחת באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני.
לאחר שהתאים שקעו על הממברנה, מדוד עמידות חשמלית טרנס-פיתלית או TEER מדי יום ודמיין את הממברנה מכניסה באמצעות מיקרוסקופ. כדי לרענן את המונוליירים, הסר את המדיום מהתאים הבזולטרליים של הצלחת המכילה את מכניסות הממברנה, ולאחר מכן שאף בזהירות את המדיום מהתאים האפיים. הוסיפו 150 מיקרוליטרים של IEM טרי בכל תא אפיקל והוסיפו 800 מיקרוליטרים של IEM טרי לכל תא בזולטרלי.
אם משתמשים במד TEER ידני, נקו את האלקטרודה עם 70% אתנול ותנו לה להתייבש באוויר בתוך ארון הבטיחות הביולוגית, ואז הניחו את האלקטרודה בצינור המכיל BM. חבר את האלקטרודה למד ה- TEER הידני וסובב את מתג הפונקציה למדידה באוהם ובמתג ההפעלה. מניחים את האלקטרודה הקצרה בתא האפי של התוסף ואת האלקטרודה הארוכה בתא הבזולטרלי מבלי לגעת במונולייר. מדוד את ההתנגדות בבאר הריקה, ולאחר מכן בדגימות הנותרות.
לשטוף את האלקטרודה עם BM בין דגימות עם תנאים שונים. בסיום, נקו את האלקטרודה עם מי דמי ועם 70% אתנול, ואז תנו לה להתייבש באוויר. פרוטוקול זה שימש לקצירת אורגנואידים במעיים ולהכנת מונו-שכבות של תאי אפיתל.
מונולאייר שהתרבת במשך שמונה ימים ב- IEM מוצג כאן. ניתן לראות מבנה כאשר חושפים מונו-שכבות למדיום התמיינות אנטרוציטים או EDM, בעוד שמונו-שכבות שנחשפו למדיום משולב או CDM מראות מבנה חלק יותר. היווצרות מונולאייר הייתה כמותית ואחריה מדידת TEER.
למונולאייר מפגשי לחלוטין היה ערך TEER של כ-100 אוהם סנטימטר בריבוע, אשר עלה כאשר נחשף למדיום ההבחנה. מונו-שכבות בכל התנאים הבינוניים הראו חדירות נמוכה יותר לכאורה לצהוב לוציפר. הפרשת Lysozyme על ידי חד-שכבתיים איליים המתורבתים ב- IEM הייתה גבוהה יותר מזו של חד-שכבתיים המתורבתים ב- IEM עד למפגש ובמשך ארבעה ימים נוספים ב- EDM או CDM.
מונו-שכבות שעברו תרבית ב-IEM, ב-IEM וב-EDM שלאחר מכן, או ב-IEM וב-CDM שלאחר מכן, מראים הבדלים במורפולוגיה שנצפתה עם הכתמים הכחולים של H&E, Ki67, MUC2 ו-Alcian Blue. עם התמיינות, התאים המתרבים פחתו, בעוד שביטוי הגנים של תאי גביע וסמן אנטרוציטים עלה בהשוואה לזה שנצפה בתנאי IEM כפי שהוכח על ידי LGR5, MUC2 וביטוי גנים של פוספטאז אלקליין. בעת הכנת monolayers, חשוב למנוע anoikis באורגנואידים לאחר העיכול אותם.
בנוסף, ECM בתאים צריך להיות מופץ באופן שווה על ממברנות Transwell. מונו-שכבות שמקורן באורגנואידים מאפשרות הערכה של הובלות מולקולות באמצעות מצעים פלואורסצנטיים שונים באופן ספציפי למטופל.
