오가노이드 유래 단층은 환자의 장 상피 장벽 기능을 재검토하고 각 환자의 기능 장애를 개선하기위한 치료법의 효과를 테스트하여 개인화 된 치료 전략을 식별 할 수있게합니다. 오가노이드 단층은 손상이 발생하는 측면 인 상피의 정점 측면에 대한 액세스를 제공하며 3D 구조로 성장하는 오가노이드에서 정상적이고 접근 할 수 있습니다. 모든 오가노이드는 다르므로 투쟁이 다릅니다.
단단한 단층을 형성하려면 증식 단계에서 오가노이드를 사용하고 빠르게 소화하여 두 개에서 네 개의 세포로 구성된 클러스터를 형성하십시오. 모든 모델에 대해 세포 시딩을 적정하십시오. 이 절차를 시연하는 것은 HUB의 선임 연구원 인 Wies Van Dooremalen이 수행 할 것입니다.
멤브레인 삽입물을 세포외 매트릭스 또는 ECM으로 코팅하여 시작합니다. 생물 안전 캐비닛에서 작업하면서 멤브레인 인서트를 지지판에 놓습니다. ECM 40X를 얼음처럼 차가운 DPBS에 칼슘과 마그네슘으로 희석한 다음, 희석된 ECM 150 마이크로리터를 각 삽입물의 정점 구획에 피펫한다.
플레이트를 섭씨 37도에서 적어도 한 시간 동안 인큐베이션한다. 시딩을 위해 세포를 준비하려면 섭씨 37도 수조에서 세포 해리 시약의 분취량을 미리 준비하십시오. 여섯 웰 플레이트의 각 웰에 대해 두 밀리리터의 시약을 사용하십시오.
오가노이드를 함유하는 배양 플레이트를 인큐베이터로부터 생물안전 캐비닛으로 옮긴다. 텍스트 원고에 설명 된대로 오가노이드를 처리하지만 여러 튜브를 하나의 튜브로 풀링하지 마십시오. 오가노이드를 수확 한 후, 기본 배지 또는 BM을 12 밀리리터에 첨가하고 85 배 G에서 원심 분리한 다음 상청액을 흡인하십시오.
오가노이드가 들어있는 튜브를 최대 12 밀리리터의 DPBS로 채운 다음 10 밀리리터 피펫을 사용하여 10 번 위아래로 피펫하십시오. 섭씨 8도에서 5분 동안 85배 G에서 원심분리하고, 오가노이드 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 흡인한다. 미리 가온된 세포 해리 시약을 오가노이드에 첨가하고 재현탁시킨 다음, 튜브를 섭씨 37도의 수조에서 5분 동안 대각선 또는 수평으로 인큐베이션한다.
인큐베이션 후, 다섯 밀리리터 멸균 플라스틱 피펫 또는 P1000 피펫을 사용하여 10회 상하로 피펫을 상하로 피펫한다. 현미경으로 오가노이드 현탁액을 확인하여 단일 세포와 두 개 내지 네 개의 세포로 구성된 일부 세포 덩어리의 혼합물이 형성되었는지 확인하십시오. 세포 현탁액에 ROCK 억제제와 함께 최대 12 밀리리터의 BM을 첨가하여 세포 해리를 중지하십시오.
세포를 원심분리한 다음, 세포 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 흡인한다. 여러 튜브에서 동일한 오가노이드 배양물을 처리할 때, 세포 펠릿을 풀링한 후 12밀리리터의 BM에 재현탁시킨다. BM으로 미리 습윤된 40마이크로미터 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 여과하고 50밀리리터 원뿔형 튜브로 유동 스루를 수확한 다음, 10밀리리터의 BM으로 스트레이너를 세척하고 동일한 튜브로 유동 스루를 수확합니다. 긴장된 세포 현탁액을 두 개의 새로운 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮기고 원심분리를 반복한다.
세포 펠릿을 교란시키지 않고 상청액을 흡인하고, 출발 물질로 사용된 전체 배양 플레이트 당 10 마이크로몰 ROCK 억제제로 보충된 IEM의 네 밀리리터에 세포를 재현탁시킨다. 소량의 세포 현탁액을 일대일 비율로 Trypan Blue와 혼합하여 계산 한 다음 세포를 계수하고 살아있는 세포의 총 수를 계산하여 각 개별 세포를 작은 덩어리로 계산합니다. 10 마이크로몰 ROCK 억제제로 보충된 IEM의 밀리리터 당 여섯 번째 살아있는 세포에 3X 10을 함유하는 세포 현탁액을 제조하였다.
세포를 시드하려면 ECM 코팅 인서트에서 DPBS를 조심스럽게 흡인하여 플레이트를 수평으로 유지하십시오. ROCK 억제제로 보충된 IEM 800 마이크로리터를 각각의 기저측성 구획에 피펫하고, ECM 코팅된 막 상에 제조된 150 마이크로리터의 세포 현탁액을 정점 구획에 적가한다. 플레이트를 인큐베이터에 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에 놓습니다.
일단 세포가 막 상에 침전되면, 매일 경상피 전기 저항 또는 TEER를 측정하고 현미경을 사용하여 막 삽입물을 이미지화하십시오. 단층을 새로 고치려면, 막 삽입물을 함유하는 플레이트의 기저측성 구획으로부터 배지를 제거한 다음, 정점 구획으로부터 배지를 조심스럽게 흡인한다. 150 마이크로 리터의 신선한 IEM을 각 정점 구획에 떨어 뜨리고 800 마이크로 리터의 신선한 IEM을 각 기저 측부 구획에 첨가하십시오.
수동 TEER 미터를 사용하는 경우 70 % 에탄올로 전극을 청소하고 생물 안전 캐비닛 내부에서 공기 건조시킨 다음 BM이 들어있는 튜브에 전극을 넣으십시오. 전극을 수동 TEER 미터에 연결하고 기능 스위치를 돌려 옴 단위로 측정하고 전원 스위치를 켭니다. 짧은 전극을 인서트의 정점 구획에 놓고 단층을 만지지 않고 기저측 구획에 긴 전극을 놓습니다. 빈 웰에서 저항을 측정 한 다음 나머지 샘플에서 저항을 측정하십시오.
다른 조건을 가진 샘플 사이에서 BM으로 전극을 세척하십시오. 끝나면 데미 물과 70 % 에탄올로 전극을 닦은 다음 공기 건조하십시오. 이 프로토콜은 장내 오가노이드를 수확하고 상피 세포의 단층을 준비하는 데 사용되었습니다.
IEM에서 여덟 일 동안 배양된 단층이 여기에 표시되어 있다. 단층을 장세포 분화 배지 또는 EDM에 노출시킬 때 구조가 관찰되는 반면, 조합 배지 또는 CDM에 노출된 단층은 더 매끄러운 구조를 나타낸다. 단층 형성은 정량적으로 TEER 측정에 뒤따랐다.
완전히 합류한 단일층은 약 100 옴 센티미터 제곱의 TEER 값을 가졌고, 이는 어느 분화 배지에 노출될 때 증가하였다. 모든 중간 조건에서 단층은 루시퍼 황색에 대해 더 낮은 겉보기 투과성을 나타냈다. IEM에서 배양된 장폐색 단층에 의한 리소자임 분비는 EDM 또는 CDM에서 또 다른 나흘 동안 그리고 합류할 때까지 IEM에서 배양된 단층의 분비량보다 높았다.
IEM, IEM 및 후속 EDM, 또는 IEM 및 후속 CDM에서 배양된 단층은 H&E, Ki67, MUC2 및 Alcian Blue 염색으로 관찰된 형태학의 차이를 보여준다. 분화 시, 증식성 세포는 감소한 반면, 잔 세포 및 장세포 마커 유전자 발현은 LGR5, MUC2 및 알칼리성 포스파타제 유전자 발현으로 나타낸 바와 같이 IEM 조건 하에서 관찰된 것에 비해 증가하였다. 단층을 준비 할 때, 소화 후 오가노이드의 anoikis를 예방하는 것이 중요합니다.
추가적으로, 세포의 ECM은 트랜스웰 막에 고르게 분포되어야 한다. 오가노이드-유래 단일층은 환자 특이적 방식으로 상이한 형광 기질을 사용하는 분자 수송의 평가를 허용한다.
