I monostrati di derivazione organoide ricapitolano la funzione di barriera epiteliale intestinale del paziente e consentono di testare l'effetto delle terapie volte a migliorare la disfunzione in ciascun paziente per identificare strategie di trattamento personalizzate. I monostrati organoidi forniscono l'accesso al lato apicale dell'epitelio, che è il lato in cui si verifica il danno, ed è normale e accessibile negli organoidi che crescono come strutture 3D. Ogni organoide è diverso, da qui la lotta.
Per formare monostrati stretti, utilizzare organoidi in fase di proliferazione e digerire rapidamente per formare gruppi da due a quattro cellule. Titolare la semina cellulare per ogni modello. La dimostrazione della procedura sarà eseguita da Wies Van Dooremalen, un ricercatore associato senior di HUB.
Inizia rivestendo gli inserti a membrana con matrice extracellulare o ECM. Lavorando in un armadio di biosicurezza, posizionare gli inserti della membrana nella piastra di supporto. Diluire l'ECM 40X in DPBS ghiacciato con calcio e magnesio, quindi pipettare 150 microlitri dell'ECM diluito nel compartimento apicale di ciascun inserto.
Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per almeno un'ora. Per preparare le cellule per la semina, prima della guerra un'aliquota del reagente di dissociazione cellulare in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius. Utilizzare due millilitri del reagente per ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti.
Trasferire la piastra di coltura contenente gli organoidi dall'incubatore all'armadio di biosicurezza. Elaborare gli organoidi come descritto nel manoscritto di testo, ma non raggruppare più tubi in un tubo. Dopo aver raccolto gli organoidi, aggiungere il mezzo basale o BM a 12 millilitri e centrifugare a 85 volte G, quindi aspirare il surnatante.
Riempire il tubo contenente gli organoidi con un massimo di 12 millilitri di DPBS, quindi pipettare su e giù 10 volte usando una pipetta da 10 millilitri. Centrifugare a 85 volte G per cinque minuti a otto gradi Celsius e aspirare il surnatante senza disturbare il pellet organoide. Aggiungere il reagente di dissociazione cellulare preriscaldato agli organoidi e risospese, quindi incubare i tubi diagonalmente o orizzontalmente per cinque minuti a bagnomaria a 37 gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, pipettare su e giù 10 volte usando una pipetta di plastica sterile da cinque millilitri o una pipetta P1000. Controllare la sospensione organoide al microscopio per vedere se si è formata una miscela di singole cellule e alcuni grumi cellulari costituiti da due o quattro cellule. Arrestare la dissociazione cellulare aggiungendo fino a 12 millilitri di BM con inibitore ROCK alla sospensione cellulare.
Centrifugare le cellule, quindi aspirare il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. Quando si maneggia la stessa coltura organoide in più tubi, raggruppare i pellet di cella prima di risospenderli in 12 millilitri di BM. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro da 40 micrometri pre-bagnato con BM e raccogliere il flusso attraverso un tubo conico da 50 millilitri, quindi lavare il filtro con 10 millilitri di BM e raccogliere il flusso attraverso lo stesso tubo. Trasferire la sospensione di celle tese in due nuovi tubi conici da 15 millilitri e ripetere la centrifugazione.
Aspirare il surnatante senza disturbare il pellet cellulare e risospesciare le cellule in quattro millilitri di IEM integrati con 10 inibitori ROCK micromolari per piastra di coltura completa utilizzata come materiale di partenza. Mescolare una piccola quantità di sospensione cellulare in un rapporto uno a uno con Trypan Blue per il conteggio, quindi contare le cellule e calcolare il numero totale di cellule vive, contando ogni singola cellula in piccoli grumi. Preparare una sospensione cellulare contenente da 3X 10 a sesta cellula viva per millilitro di IEM integrata con 10 inibitori ROCK micromolari.
Per seminare le cellule, aspirare accuratamente DPBS dagli inserti rivestiti in ECM, mantenendo la piastra orizzontale. Pipetta 800 microlitri di IEM integrati con inibitore ROCK in ciascun compartimento basolaterale e 150 microlitri della sospensione cellulare preparati sulla membrana rivestita di ECM nel compartimento apicale a goccia. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.
Una volta che le cellule si sono sedimentate sulla membrana, misurare la resistenza elettrica transepiteliale o TEER ogni giorno e visualizzare gli inserti della membrana usando un microscopio. Per rinfrescare i monostrati, rimuovere il mezzo dai compartimenti basolaterali della piastra contenente gli inserti a membrana, quindi aspirare accuratamente il mezzo dai compartimenti apicali. Aggiungi 150 microlitri di IEM fresco a goccia a ciascun compartimento apicale e aggiungi 800 microlitri di IEM fresco a ciascun compartimento basolaterale.
Se si utilizza un misuratore TEER manuale, pulire l'elettrodo con etanolo al 70% e lasciarlo asciugare all'aria all'interno dell'armadio di biosicurezza, quindi posizionare l'elettrodo in un tubo contenente BM. Collegare l'elettrodo al misuratore TEER manuale e ruotare l'interruttore funzione per misurare in ohm e accendere l'interruttore di alimentazione. Posizionare l'elettrodo corto nel compartimento apicale dell'inserto e l'elettrodo lungo nel compartimento basolaterale senza toccare il monostrato. Misurare la resistenza nel pozzo bianco, quindi nei campioni rimanenti.
Lavare l'elettrodo con BM tra campioni con condizioni diverse. Al termine, pulire l'elettrodo con acqua demi e con etanolo al 70%, quindi lasciarlo asciugare all'aria. Questo protocollo è stato utilizzato per raccogliere organoidi intestinali e preparare monostrati di cellule epiteliali.
Un monostrato che è stato coltivato per otto giorni in IEM è mostrato qui. Una struttura può essere osservata quando si espongono monostrati al mezzo di differenziazione degli enterociti o EDM, mentre i monostrati esposti al mezzo combinato o CDM mostrano una struttura più liscia. La formazione di monostrati è stata quantitativamente seguita dalla misurazione del TEER.
Un monostrato completamente confluente aveva un valore TEER di circa 100 ohm centimetri quadrati che aumentava se esposto a entrambi i mezzi di differenziazione. I monostrati in tutte le condizioni medie hanno mostrato una minore permeabilità apparente al giallo lucifero. La secrezione di lisozima da parte di monostrati ileali coltivati in IEM è stata superiore a quella dei monostrati coltivati in IEM fino alla confluenza e per altri quattro giorni in EDM o CDM.
I monostrati coltivati in IEM, IEM e successivamente EDM, o IEM e successivo CDM mostrano differenze nella morfologia osservate con le colorazioni H&E, Ki67, MUC2 e Alcian Blue. Dopo la differenziazione, le cellule proliferative sono diminuite, mentre l'espressione genica delle cellule caliciari e dei marcatori enterociti è aumentata rispetto a quella osservata in condizioni IEM come mostrato dall'espressione genica LGR5, MUC2 e fosfatasi alcalina. Quando si preparano monostrati, è importante prevenire l'anoikis negli organoidi dopo averli digeriti.
Inoltre, l'ECM nelle cellule deve essere distribuito uniformemente sulle membrane Transwell. I monostrati derivati da organoidi consentono la valutazione dei trasporti molecolari utilizzando diversi substrati fluorescenti in modo specifico per il paziente.
