この方法は、細胞への脂肪酸の送達を改善し、遊離脂肪酸送達の毒性作用から細胞を保護し、したがって、より一貫した標識を保証する。クリックケミストリー検出の感度と効率は、脂肪酸標識の効果的な取り込みに依存します。私たちは、これが大幅に改善できることを示しました。
プロトコルのいくつかのステップは非常に具体的であり、厳密に従う必要があります。視覚的なデモンストレーションは、例えば、ラベリングミックス中の固体の形成を回避する方法を明確にし、示すことができる。標識培地を調製するには、DMEMに5%デキストラン/木炭コーティングFBS、1Xペニシリンストレプトマイシン、2ミリモルL-グルタミン、および100ミリモルピルビン酸ナトリウムを補充し、使用前に摂氏37度に予温します。
1日前に6ウェル組織培養皿に播種したHEK-293 T細胞をPBSで穏やかに洗浄し、次いでPBSを標識培地と交換する。細胞を摂氏37度で5%の二酸化炭素で約45分間インキュベートしてから、脂肪酸による代謝標識に進みます。脂肪酸類似体をケン化するために、少なくとも2マイクロリットルのアルキニル脂肪酸類似体を3ミリリットルの円錐形反応バイアルの底部に直接ピペットする。
等量の希釈水酸化カリウムをガラスの端の反応バイアルの底部近くにピペットで、分注された量の水酸化カリウムが脂肪酸と混合するようにする。バイアルの蓋を閉じ、静かにタップして溶液を混合します。反応バイアルを摂氏65度で約5分間、または溶液が透明になるまで加熱し、脂肪酸が組み込まれたことを示す。
ただし、液体が蒸発しすぎないように注意してください。次に、ピペットで脂肪酸非含有BSAに対する脂肪酸対水酸化カリウムの体積比が1~1~50となるように脂肪酸非含有BSAを予め加温し、終濃度20倍のBSA結合アルキニル脂肪酸を達成した。溶液を上下にピペッティングして混合し、摂氏37度で15分間インキュベートする。
20X脂肪酸BSAコンジュゲートを飢餓培地に直接添加してHEK-293 T細胞を標識し、25マイクロモルのミリスチン酸アルキニルまたは100マイクロモルのパルミチン酸アルキニルおよびステアリン酸アルキニル中の1%BSAの最終濃度を達成します。比較のために、2マイクロリットルの非標識脂肪酸を飢餓培地に直接ピペッティングすることによって非ケン化液体を加え、次いで細胞をインキュベーターに3〜6時間戻した。インキュベーションが完了した後、室温でPBSで細胞を穏やかに洗浄し、次いで500マイクロリットルのEDTA非含有修飾RIPA緩衝液を添加し、溶解物を摂氏4度で15分間回転させることによって細胞を回収および溶解する。
溶解液を16,000倍Gで摂氏4度で10分間遠心分離し、上清を1.7ミリリットルの微量遠心チューブに集め、マイナス20°Cで保存します。EDTAフリーの改変RIPAバッファーを使用して、1.7ミリリットルのマイクロ遠心チューブに50~100マイクログラムのタンパク質溶解液を等量に持ち込みます。反応量はできるだけ小さくしてください。
各サンプルにSTSを加えて最終濃度1%を達成するクリック試薬のマスターミックスを調製し、溶解物に適切な量を加え、上下にピペッティングして混合します。溶解物を暗所で30分間、摂氏37度の水浴中で時折混合しながらインキュベートする。免疫沈降のために、溶解物をウサギ抗GFPと混合し、摂氏4度で回転させて一晩インキュベートする。
0.1%SDS RIPAで予め平衡化した15~20マイクロリットルの磁気ビーズを各チューブに加え、摂氏4度で3時間、端から端まで反応させます。ビーズを溶解バッファーで洗浄し、1%SDS を含む 45 マイクロリットルの 50 ミリモル HEPESバッファーに再懸濁します。ビーズを摂氏80度で15分間加熱する。
インキュベーション中は、チューブを約5分ごとに反転または攪拌し、すべてのチューブを短時間回転させます。サンプルがまだ温かいうちに、タンパク質を含む上清を収集します。43マイクロリットルの上清と7マイクロリットルのクリック試薬マスターミックスを組み合わせ、37°Cで30分間暗闇の中で反応させます。
西洋のプロットでは、アシル鎖の長さが長くなったケン化アルキニル脂肪酸と非ケン化アルキニル脂肪酸の間のクリックケミストリー検出の標識効率に顕著な効果が観察されました。ステアリン酸アルキニルで標識された細胞では、脂肪酸のケン化および代謝標識のためのBSAによる送達により、クリックケミストリーおよび蛍光アジトプローブによる検出によるSアシル化タンパク質シグナルの検出が劇的に増加し、アルキニル脂肪酸標識の細胞内包の全体的な増加が示唆された。逆に、ミリスチン酸アルキニルを最短かつ最も可溶性の脂肪酸で処理した細胞では顕著な差は認められなかった。
パルミチン酸アルキニルで標識された細胞は、ミリスチン酸アルキニルと比較して標識の中間的な増加を示したが、ステアリン酸アルキニルよりも少ない。重要なことに、PVDF膜を0.1モルの水酸化カリウムで処理すると、パルミチン酸アルキニルおよびステアリン酸アルキニルと共にインキュベートした細胞から脂肪酸標識の大部分が除去され、シグナルの大部分がエステル結合またはチオエステル結合を介していたことが確認された。予想通り、ミリスチン酸アルキニルの取り込みは、アミド結合を介してタンパク質にミリスチン酸が結合するため、ほとんどがアルカリ耐性であった。
クリックケミストリーに続いて、野生型ミリストイル化C末端ハンチントンGFPのミリストイル化が免疫沈降物および溶解物中に検出されたが、G2A変異はC末端ハンチントンGFPのミリストイル化を完全に遮断した。クリックケミストリーに続いて、質量分析用の脂肪アシル化タンパク質のアフィニティー精製を行うことができます。これは、細胞を毒性から保護することによって脂肪アシル化タンパク質の異なるプロファイルをもたらし得る。
