تعمل هذه الطريقة على تحسين توصيل الأحماض الدهنية إلى الخلايا وحمايتها من الآثار السامة لتوصيل الأحماض الدهنية المجانية ، وبالتالي ضمان وضع علامات أكثر اتساقا. تعتمد حساسية وكفاءة الكشف عن كيمياء النقر على الامتصاص الفعال لملصق الأحماض الدهنية. وقد أظهرنا أن هذا يمكن تحسينه إلى حد كبير.
هناك عدة خطوات من البروتوكول محددة للغاية ويجب اتباعها عن كثب. يمكن أن يوضح العرض المرئي ويظهر ، على سبيل المثال ، كيفية تجنب تكوين المواد الصلبة في مزيج وضع العلامات. لتحضير وسائط وضع العلامات ، استكمل DMEM ب 5٪ dextran / الفحم المطلي FBS ، و 1X البنسلين الستربتومايسين ، واثنين من المليمولار L-glutamine ، و 100 ملليمولار بيروفات الصوديوم ، ثم قم بتسخينه إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
اغسل بلطف الخلايا التائية HEK-293 المطلية قبل يوم واحد في طبق زراعة الأنسجة المكون من ستة آبار مع PBS ، ثم استبدل PBS بوسائط وضع العلامات. احتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 45 دقيقة تقريبا قبل الشروع في وضع العلامات الأيضية بالأحماض الدهنية. لتصبن نظائر الأحماض الدهنية ، ماصة ما لا يقل عن ميكرولترين من الأحماض الدهنية ألكينيل التناظرية مباشرة في الجزء السفلي من قارورة تفاعل مخروطية ثلاثة ملليلترات.
ماصة كمية متساوية من هيدروكسيد البوتاسيوم المخفف بالقرب من الجزء السفلي من قارورة التفاعل على حافة الزجاج بحيث يختلط الحجم المستغنى عنه من هيدروكسيد البوتاسيوم مع الأحماض الدهنية. أغلق غطاء القارورة واضغط برفق لخلط المحاليل. سخني قارورة التفاعل عند 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق تقريبا أو حتى يصبح المحلول واضحا ، مما يشير إلى أن الحمض الدهني قد تم دمجه.
ومع ذلك ، احرص على ألا يتبخر السائل كثيرا. بعد ذلك ، قامت الماصة بتسخين BSA الخالي من الأحماض الدهنية بنسبة 20٪ مسبقا بحيث تكون نسبة حجم الأحماض الدهنية إلى هيدروكسيد البوتاسيوم إلى BSA الخالية من الأحماض الدهنية هي 1-1-50 ، مما يحقق تركيزا نهائيا من أحماض الألكنيل الدهنية المرتبطة ب 20X BSA. امزج المحلول عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ، ثم احتضنه لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
قم بتسمية الخلايا التائية HEK-293 عن طريق إضافة الأحماض الدهنية 20X BSA المترافقة مباشرة إلى وسائط التجويع لتحقيق تركيز نهائي بنسبة 1٪ BSA في 25 ميكرومولار ألكينيل ميريستات أو 100 ميكرومولار ألكينيل بالميتات وستيرات ألكينيل. للمقارنة، أضف سوائل غير صابونية عن طريق سحب ميكرولترين من الأحماض الدهنية غير المصنفة مباشرة إلى وسائط التجويع، ثم ضع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة لمدة ثلاث إلى ست ساعات. بعد اكتمال الحضانة ، اغسل الخلايا بلطف باستخدام PBS في درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بحصاد الخلايا وتحليلها بإضافة 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت المعدل RIPA الخالي من EDTA وتدوير الليزات لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.
قم بالطرد المركزي للليزات عند 16،000 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، ثم جمع supernatant في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.7 ملليلتر وتخزينها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. أحضر 50 إلى 100 ميكروغرام من محللات البروتين في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.7 ملليلتر إلى حجم متساو باستخدام مخزن RIPA المعدل الخالي من EDTA. حافظ على حجم التفاعل صغيرا قدر الإمكان.
أضف STS إلى كل عينة لتحقيق تركيز نهائي قدره 1٪ قم بإعداد مزيج رئيسي من كواشف النقر وإضافة وحدات تخزين مناسبة إلى lysates ، ثم اخلطها عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. احتضن الليزات في الظلام لمدة 30 دقيقة في حمام مائي 37 درجة مئوية مع خلط من حين لآخر. لهطول الأمطار المناعية ، امزج الليزات مع الأرانب المضادة ل GFP واحتضنها بين عشية وضحاها مع الدوران عند أربع درجات مئوية.
أضف 15 إلى 20 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المتوازن مسبقا مع 0.1٪ SDS RIPA إلى كل أنبوب واسمح له بالتفاعل من النهاية إلى النهاية عند أربع درجات مئوية لمدة ثلاث ساعات. اغسل الخرز بمخزن مؤقت للتحلل وأعد تعليقه في 45 ميكرولتر من مخزن HEPES العازل 50 مللي مول الذي يحتوي على 1٪ SDS. سخني الخرز على حرارة 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
أثناء الحضانة ، قم بعكس أو تحريك الأنابيب كل خمس دقائق تقريبا ، ثم قم بتدوير جميع الأنابيب لفترة وجيزة. في حين أن العينات لا تزال دافئة ، اجمع supernatant الذي يحتوي على البروتينات. اجمع 43 ميكرولترا من السوبرناتانت مع سبعة ميكرولترات من المزيج الرئيسي لكواشف النقر واسمح لها بالتفاعل في الظلام لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
على قطعة غربية ، لوحظ تأثير ملحوظ في وضع العلامات على كفاءة الكشف عن كيمياء النقر بين أحماض الألكنيل الدهنية التصبونية وغير الصابونية مع زيادة طول سلاسل الأسيل . في الخلايا المصنفة بستيرات الألكنيل ، زاد تصبن الحمض الدهني والتسليم مع BSA لوضع العلامات الأيضية بشكل كبير من اكتشاف إشارة البروتين الأسيل S من خلال كيمياء النقر والكشف عن طريق مسبار أزيتوبروب الفلورسنت ، مما يشير إلى زيادة عامة في الدمج الخلوي لعلامة الأحماض الدهنية ألكينيل. على العكس من ذلك ، لم يلاحظ أي اختلاف ملحوظ في الخلايا المعالجة بأقصر الأحماض الدهنية وأكثرها قابلية للذوبان ألكينيل ميريستات.
أظهرت الخلايا الموسومة ببالميتات ألكينيل زيادة متوسطة في التسمية مقارنة بميريستات ألكينيل ، ولكن أقل من ستيرات ألكينيل. الأهم من ذلك ، أن معالجة أغشية PVDF مع 0.1 هيدروكسيد البوتاسيوم المولي أزالت إلى حد كبير ملصقات الأحماض الدهنية من الخلايا المحتضنة بالميتات الألكنيل وستيرات الألكنيل ، مما يؤكد أن غالبية الإشارة كانت من خلال رابطة استر أو ثيوستر. كما هو متوقع ، كان دمج الميريستات الألكينيل مقاوما للقلويات في الغالب بسبب ارتباط الميريستات بالبروتينات من خلال رابطة أميد.
بعد كيمياء النقر، تم الكشف عن myristoylation من النوع البري C-terminal Huntington GFP في الرواسب المناعية، وكذلك الليسات، في حين أن طفرة G2A منعت تماما myristoylation من C-terminal Huntington GFP. بعد كيمياء النقر، يمكننا إجراء تنقية التقارب للبروتينات الأسيلية الدهنية لقياس الطيف الكتلي. هذا قد يؤدي إلى ملف تعريف مختلف من البروتينات الأسيل الدهنية عن طريق حماية الخلايا من السمية.
