Diese Methode verbessert die Abgabe von Fettsäuren an die Zellen und schützt sie vor den toxischen Wirkungen der freien Fettsäureabgabe, wodurch eine konsistentere Kennzeichnung gewährleistet wird. Die Empfindlichkeit und Effizienz der Klickchemie-Detektion hängt von der effektiven Aufnahme der Fettsäuremarkierung ab. Wir haben gezeigt, dass dies weitgehend verbessert werden kann.
Mehrere Schritte des Protokolls sind sehr spezifisch und müssen genau befolgt werden. Eine visuelle Demonstration kann beispielsweise verdeutlichen und zeigen, wie die Bildung von Feststoffen im Etikettiermix vermieden werden kann. Um die Markierungsmedien vorzubereiten, ergänzen Sie DMEM mit 5% Dextran/Holzkohle-beschichtetem FBS, 1X Penicillin-Streptomycin, zwei millimolaren L-Glutamin und 100 millimolaren Natriumpyruvaten und wärmen Sie es dann vor Gebrauch auf 37 Grad Celsius vor.
Waschen Sie die einen Tag zuvor plattierten HEK-293-T-Zellen vorsichtig in einer Gewebekulturschale mit sechs Vertiefungen mit PBS und ersetzen Sie dann das PBS durch Etikettiermedien. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für ca. 45 Minuten, bevor Sie mit der metabolischen Markierung mit Fettsäuren fortfahren. Um die Fettsäureanaloga zu verseifen, pipettieren Sie mindestens zwei Mikroliter des Alkynylfettsäureanalogons direkt in den Boden eines drei Milliliter großen konischen Reaktionsfläschchens.
Pipettiert eine gleiche Menge verdünntes Kaliumhydroxid nahe dem Boden der Reaktionsdurchstechflasche am Rand des Glases, so dass sich das dosierte Volumen des Kaliumhydroxids mit der Fettsäure vermischt. Schließen Sie den Deckel der Durchstechflasche und klopfen Sie vorsichtig, um die Lösungen zu mischen. Erhitzen Sie die Durchstechflasche für etwa fünf Minuten bei 65 Grad Celsius oder bis die Lösung klar wird, was darauf hinweist, dass die Fettsäure eingearbeitet wurde.
Achten Sie jedoch darauf, dass die Flüssigkeit nicht zu stark verdunstet. Als nächstes pipettiert 20% fettsäurefreies BSA, so dass das Volumenverhältnis von Fettsäuren zu Kaliumhydroxid zu fettsäurefreiem BSA 1-1-50 beträgt, wodurch eine Endkonzentration von 20X BSA-gebundenen Alkynylfettsäuren erreicht wird. Mischen Sie die Lösung, indem Sie sie auf und ab pipettieren, und inkubieren Sie sie dann 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.
Beschriften Sie die HEK-293 T-Zellen, indem Sie das 20X-Fettsäure-BSA-Konjugat direkt in das Hungermedium geben, um eine Endkonzentration von 1% BSA in 25 mikromolaren Alkynylmyristat oder 100 mikromolaren Alkynylpalmitat und Alkynylstearat zu erreichen. Zum Vergleich fügen Sie nicht verseifte Flüssigkeiten hinzu, indem Sie zwei Mikroliter unmarkierte Fettsäure direkt in die Hungermedien pipettieren und die Zellen dann für drei bis sechs Stunden wieder in den Inkubator geben. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, waschen Sie die Zellen vorsichtig mit PBS bei Raumtemperatur, dann ernten und lysieren Sie die Zellen, indem Sie 500 Mikroliter EDTA-freien modifizierten RIPA-Puffer hinzufügen und die Lysate für 15 Minuten bei vier Grad Celsius drehen.
Zentrifugieren Sie die Lysate bei 16.000 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, sammeln Sie dann den Überstand in 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius. Bringen Sie 50 bis 100 Mikrogramm Proteinlysate in 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit dem EDTA-freien modifizierten RIPA-Puffer auf ein gleiches Volumen. Halten Sie das Reaktionsvolumen so klein wie möglich.
Geben Sie STS zu jeder Probe, um eine Endkonzentration von 1% zu erreichenBereiten Sie eine Mastermischung der Klickreagenzien vor und fügen Sie geeignete Volumina in die Lysate hinzu, dann mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten. Die Lysate im Dunkeln 30 Minuten in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad mit gelegentlichem Mischen ausbrüten. Zur Immunpräzipitation Lysate mit Kaninchen-Anti-GFP mischen und über Nacht mit einer Rotation bei vier Grad Celsius inkubieren.
Fügen Sie 15 bis 20 Mikroliter magnetische Perlen, die mit 0,1% SDS RIPA voräquilibriert sind, zu jeder Röhre hinzu und lassen Sie sie drei Stunden lang bei vier Grad Celsius Ende über Ende reagieren. Waschen Sie die Perlen mit Lysepuffer und resuspendieren Sie in 45 Mikrolitern 50 millimolar HEPES-Puffer mit 1% SDS. Erhitzen Sie die Perlen bei 80 Grad Celsius für 15 Minuten.
Drehen oder rühren Sie die Röhren während der Inkubation etwa alle fünf Minuten um und drehen Sie dann kurz alle Röhren. Während die Proben noch warm sind, sammeln Sie den Überstand, der die Proteine enthält. Kombinieren Sie 43 Mikroliter des Überstands mit sieben Mikrolitern des Klickreagenzien-Mastermixes und lassen Sie sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius im Dunkeln reagieren.
Auf einem westlichen Diagramm wurde ein spürbarer Effekt bei der Markierungseffizienz für den Nachweis der Klickchemie zwischen verseiften und nicht verseiften Alkynylfettsäuren mit zunehmender Länge der Acylketten beobachtet. In Zellen, die mit Alkynylstearat markiert sind, erhöhte die Verseifung der Fettsäure und die Abgabe mit BSA zur metabolischen Markierung den Nachweis des S-acylierten Proteinsignals durch Klickchemie und den Nachweis durch eine fluoreszierende Azitosonde drastisch, was auf eine allgemeine Zunahme der zellulären Inkorporation des Alkynylfettsäure-Labels hindeutet. Umgekehrt wurde kein merklicher Unterschied in Zellen beobachtet, die mit der kürzesten und löslichsten Fettsäure Alkinylolmyristat behandelt wurden.
Zellen, die mit Alkynylpalmitat markiert waren, zeigten einen mittleren Anstieg der Markierung im Vergleich zu Alkynylmyristat, aber weniger als Alkynylstearat. Wichtig ist, dass die Behandlung von PVDF-Membranen mit 0,1 molaren Kaliumhydroxid die Fettsäuremarkierungen von Zellen, die mit Alkynylpalmitat und dem Alkynylstearat inkubiert wurden, weitgehend entfernt hat, was bestätigt, dass der Großteil des Signals durch eine Ester- oder Thioesterbindung erfolgte. Wie erwartet, war der Einbau von Alkynylmyristat aufgrund der Bindung von Myristat an Proteine durch eine Amidbindung meist alkaliresistent.
Nach der Klickchemie wurde die Myristoylierung des myristoylierten C-terminalen Huntington-GFP vom Wildtyp in den Immunpräzipitaten sowie in den Lysaten nachgewiesen, während die G2A-Mutation die Myristoylierung des C-terminalen Huntington-GFP vollständig blockierte. Nach der Klickchemie können wir eine Affinitätsreinigung von fettacylierten Proteinen für die Massenspektrometrie durchführen. Dies kann zu einem anderen Profil von fettacylierten Proteinen führen, indem es die Zellen vor Toxizität schützt.
