Questo metodo migliora la consegna di acidi grassi alle cellule e le protegge dagli effetti tossici della somministrazione di acidi grassi liberi, garantendo così un'etichettatura più coerente. La sensibilità e l'efficienza del rilevamento della chimica dei clic dipendono dall'assorbimento effettivo dell'etichetta degli acidi grassi. Abbiamo dimostrato che questo può essere ampiamente migliorato.
Diversi passaggi del protocollo sono molto specifici e devono essere seguiti da vicino. Una dimostrazione visiva può chiarire e mostrare, ad esempio, come evitare la formazione di solidi nel mix di etichettatura. Per preparare il mezzo di etichettatura, integrare DMEM con FBS rivestito di destrano / carbone 5%, 1X penicillina streptomicina, due millimolari L-glutammina e 100 millimolare piruvato di sodio, quindi preriscaldarlo a 37 gradi Celsius prima dell'uso.
Lavare delicatamente le cellule T HEK-293 placcate un giorno prima in un piatto di coltura di tessuti a sei pozzetti con PBS, quindi sostituire il PBS con un mezzo di etichettatura. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per circa 45 minuti prima di procedere all'etichettatura metabolica con acidi grassi. Per saponificare gli analoghi degli acidi grassi, pipettare almeno due microlitri dell'analogo dell'acido grasso alchinile direttamente sul fondo di una fiala di reazione conica da tre millilitri.
Pipettare una quantità uguale di idrossido di potassio diluito vicino al fondo del flaconcino di reazione sul bordo del vetro in modo tale che il volume erogato dell'idrossido di potassio si mescoli con l'acido grasso. Chiudere il coperchio del flaconcino e picchiettare delicatamente per miscelare le soluzioni. Riscaldare il flaconcino di reazione a 65 gradi Celsius per circa cinque minuti o fino a quando la soluzione diventa chiara, indicando che l'acido grasso è stato incorporato.
Tuttavia, fai attenzione che il liquido non evapori troppo. Successivamente, la pipetta ha preriscaldato il BSA privo di acidi grassi al 20% in modo tale che il rapporto di volume tra acidi grassi e idrossido di potassio e BSA privo di acidi grassi sia 1-1-50, raggiungendo una concentrazione finale di acidi grassi alchinili legati a BSA 20X. Mescolare la soluzione pipettando su e giù, quindi incubarla per 15 minuti a 37 gradi Celsius.
Etichettare le cellule T HEK-293 aggiungendo il coniugato di acido grasso BSA 20X direttamente nel mezzo di fame per ottenere una concentrazione finale dell'1% di BSA in 25 micromolari alchil miristato o 100 micromolari alchil palmitato e alchil stearato. Per confronto, aggiungere liquidi non saponificati pipettando due microlitri di acido grasso non etichettato direttamente nel mezzo di fame, quindi riposizionare le cellule nell'incubatore per tre-sei ore. Al termine dell'incubazione, lavare delicatamente le cellule con PBS a temperatura ambiente, quindi raccogliere e lisare le cellule aggiungendo 500 microlitri tampone RIPA modificato privo di EDTA e ruotando i lisati per 15 minuti a quattro gradi Celsius.
Centrifugare i lisati a 16.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius, quindi raccogliere il surnatante in tubi microcentrifuga da 1,7 millilitri e conservarli a meno 20 gradi Celsius. Portare da 50 a 100 microgrammi di lisati proteici in tubi microcentrifuga da 1,7 millilitri a un volume uguale utilizzando il tampone RIPA modificato privo di EDTA. Mantenere il volume di reazione il più piccolo possibile.
Aggiungere STS a ciascun campione per ottenere una concentrazione finale dell'1%Preparare una miscela principale dei reagenti click e aggiungere i volumi appropriati nei lisati, quindi mescolare mediante pipettaggio su e giù. Incubare i lisati al buio per 30 minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius con miscelazione occasionale. Per l'immunoprecipitazione, mescolare lisati con coniglio anti-GFP e incubare durante la notte con rotazione a quattro gradi Celsius.
Aggiungere da 15 a 20 microlitri di perline magnetiche pre-bilanciate con 0,1% SDS RIPA a ciascun tubo e lasciare che reagisca da un capo all'altro a quattro gradi Celsius per tre ore. Lavare le perline con tampone di lisi e risospese in 45 microlitri di tampone HEPES da 50 millimolari contenente l'1% di SDS. Riscaldare le perline a 80 gradi Celsius per 15 minuti.
Durante l'incubazione, invertire o agitare i tubi circa ogni cinque minuti, quindi ruotare brevemente tutti i tubi. Mentre i campioni sono ancora caldi, raccogliere il surnatante contenente le proteine. Combina 43 microlitri del surnatante con sette microlitri del mix master di reagenti click e lascia che reagiscano al buio per 30 minuti a 37 gradi Celsius.
Su un grafico occidentale, è stato osservato un effetto notevole nell'efficienza di etichettatura per il rilevamento della chimica dei clic tra acidi grassi alchinil saponificati e non saponificati con una lunghezza crescente delle catene aciliche. Nelle cellule etichettate con alchil stearato, la saponificazione dell'acido grasso e la somministrazione con BSA per l'etichettatura metabolica hanno aumentato drasticamente il rilevamento del segnale proteico S-acilato attraverso la chimica del clic e il rilevamento da parte di un'azitosproba fluorescente, suggerendo un aumento complessivo dell'incorporazione cellulare dell'etichetta dell'acido grasso alchinico. Al contrario, non è stata osservata alcuna differenza evidente nelle cellule trattate con l'acido grasso più corto e più solubile alchil miristato.
Le cellule marcate con palmitato di alchil hanno mostrato un aumento intermedio dell'etichetta rispetto all'alchil miristato, ma inferiore all'alchil stearato. È importante sottolineare che il trattamento delle membrane PVDF con idrossido di potassio molare 0,1 ha in gran parte rimosso le etichette degli acidi grassi dalle cellule incubate con palmitato di alchinile e alchil stearato, confermando che la maggior parte del segnale era attraverso un legame estere o tioestere. Come previsto, l'incorporazione di alchil miristato era per lo più resistente agli alcali a causa dell'attaccamento del miristato alle proteine attraverso un legame ammidico.
A seguito della chimica dei clic, la miristoilazione della HFP di Huntington C-terminale miristoilata wild type è stata rilevata negli immunoprecipitati, così come nei lisati, mentre la mutazione G2A ha completamente bloccato la miristoilazione della GFP Huntington C-terminale. Seguendo la chimica dei clic, possiamo eseguire la purificazione di affinità delle proteine acilate grasse per la spettrometria di massa. Questo può produrre un diverso profilo di proteine acilate grasse proteggendo le cellule dalla tossicità.
