Cette méthode améliore l’apport d’acides gras aux cellules et les protège des effets toxiques de l’administration d’acides gras libres, assurant ainsi un étiquetage plus cohérent. La sensibilité et l’efficacité de la détection de la chimie du clic dépendent de l’absorption efficace de l’étiquette des acides gras. Nous avons montré que cela peut être largement amélioré.
Plusieurs étapes du protocole sont très spécifiques et doivent être suivies de près. Une démonstration visuelle peut clarifier et montrer, par exemple, comment éviter la formation de solides dans le mélange d’étiquetage. Pour préparer le milieu d’étiquetage, complétez le DMEM avec 5% de FBS enduit de dextran / charbon de bois, 1X streptomycine de pénicilline, deux millimolaires L-glutamine et 100 millimolaires de pyruvate de sodium, puis pré-pré-préchauffer à 37 degrés Celsius avant utilisation.
Lavez doucement les lymphocytes T HEK-293 plaqués la veille dans une boîte de culture tissulaire à six puits avec du PBS, puis remplacez le PBS par un support d’étiquetage. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant environ 45 minutes avant de procéder au marquage métabolique avec des acides gras. Pour saponifier les analogues d’acides gras, pipettez au moins deux microlitres de l’analogue d’acide gras alcynyle directement dans le fond d’un flacon de réaction conique de trois millilitres.
Pipeter une quantité égale d’hydroxyde de potassium dilué près du fond du flacon de réaction sur le bord du verre de telle sorte que le volume distribué de l’hydroxyde de potassium se mélange à l’acide gras. Fermez le couvercle du flacon et tapotez doucement pour mélanger les solutions. Chauffer le flacon de réaction à 65 degrés Celsius pendant environ cinq minutes ou jusqu’à ce que la solution devienne claire, indiquant que l’acide gras a été incorporé.
Cependant, veillez à ce que le liquide ne s’évapore pas trop. Ensuite, pipette préchauffée 20% de BSA sans acides gras de sorte que le rapport volumique des acides gras à l’hydroxyde de potassium à la BSA sans acides gras est de 1-1-50, atteignant une concentration finale de 20X acides gras alcynyliques liés à la BSA. Mélanger la solution en pipetant de haut en bas, puis l’incuber pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius.
Marquez les lymphocytes T HEK-293 en ajoutant le conjugué BSA d’acide gras 20X directement dans le milieu de famine pour atteindre une concentration finale de 1% de BSA dans 25 myristate d’alcynyle micromolaire ou 100 palmitate d’alcynyle micromolaires et stéarate d’alcynyle. À titre de comparaison, ajoutez des liquides non saponifiés en pipetant deux microlitres d’acide gras non marqué directement dans le milieu de famine, puis replacez les cellules dans l’incubateur pendant trois à six heures. Une fois l’incubation terminée, lavez doucement les cellules avec du PBS à température ambiante, puis récoltez et lysez les cellules en ajoutant 500 microlitres de tampon RIPA modifié sans EDTA et en faisant pivoter les lysats pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.
Centrifugez les lysats à 16 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, puis collectez le surnageant dans des tubes de microcentrifugation de 1,7 millilitre et stockez-les à moins 20 degrés Celsius. Porter 50 à 100 microgrammes de lysats de protéines dans des tubes de microcentrifugation de 1,7 millilitre à un volume égal à l’aide du tampon RIPA modifié sans EDTA. Gardez le volume de réaction aussi petit que possible.
Ajouter STS à chaque échantillon pour atteindre une concentration finale de 1 %Préparer un mélange maître des réactifs de clic et ajouter les volumes appropriés dans les lysats, puis mélanger en pipetant de haut en bas. Incuber les lysats dans l’obscurité pendant 30 minutes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius avec un mélange occasionnel. Pour l’immunoprécipitation, mélanger les lysats avec l’anti-GFP de lapin et incuber pendant la nuit avec une rotation à quatre degrés Celsius.
Ajouter 15 à 20 microlitres de billes magnétiques prééquilibrées avec 0,1% SDS RIPA à chaque tube et le laisser réagir bout à bout à quatre degrés Celsius pendant trois heures. Lavez les billes avec un tampon de lyse et remettez en suspension dans 45 microlitres de tampon HEPES de 50 millimolaires contenant 1% de FDS. Chauffer les perles à 80 degrés Celsius pendant 15 minutes.
Pendant l’incubation, inverser ou agiter les tubes environ toutes les cinq minutes, puis faire tourner brièvement tous les tubes. Pendant que les échantillons sont encore chauds, prélevez le surnageant contenant les protéines. Combinez 43 microlitres du surnageant avec sept microlitres du mélange maître des réactifs de clic et laissez-les réagir dans l’obscurité pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.
Sur un diagramme occidental, un effet notable a été observé dans l’efficacité du marquage pour la détection de la chimie du clic entre les acides gras alcynyliques saponifiés et non saponifiés avec une longueur croissante des chaînes acyliques. Dans les cellules marquées avec du stéarate d’alcynyle, la saponification de l’acide gras et l’administration de BSA pour le marquage métabolique ont considérablement augmenté la détection du signal de la protéine S-acylée par la chimie du clic et la détection par un azitoprobe fluorescent, suggérant une augmentation globale de l’incorporation cellulaire de l’étiquette de l’acide gras alcynyle. Inversement, aucune différence notable n’a été observée dans les cellules traitées avec le myristate d’alcynyle d’acide gras le plus court et le plus soluble.
Les cellules marquées avec du palmitate d’alcynyle ont montré une augmentation intermédiaire de l’étiquette par rapport au myristate d’alcynyle, mais inférieure au stéarate d’alcynyle. Il est important de noter que le traitement des membranes PVDF avec de l’hydroxyde de potassium à 0,1 molaire a largement éliminé les étiquettes d’acides gras des cellules incubées avec du palmitate d’alcynyle et du stéarate d’alcynyle, confirmant que la majorité du signal était à travers une liaison ester ou thioester. Comme prévu, l’incorporation du myristate d’alcynyle était principalement résistante aux alcalis en raison de la fixation du myristate aux protéines par une liaison amide.
Suite à la chimie du clic, une myristoylation de la GFP de Huntington C-terminal myristylée de type sauvage a été détectée dans les immunoprécipités, ainsi que dans les lysats, tandis que la mutation G2A a complètement bloqué la myristoylation de la GFP de Huntington C-terminale. Après la chimie du clic, nous pouvons effectuer une purification d’affinité des protéines acylées grasses pour la spectrométrie de masse. Cela peut donner un profil différent de protéines acylées grasses en protégeant les cellules de la toxicité.
