Этот метод улучшает доставку жирных кислот к клеткам и защищает их от токсического воздействия доставки свободных жирных кислот, обеспечивая тем самым более последовательную маркировку. Чувствительность и эффективность обнаружения химии щелчков зависят от эффективного поглощения этикетки жирных кислот. Мы показали, что это можно в значительной степени улучшить.
Некоторые этапы протокола являются весьма конкретными и требуют тщательного соблюдения. Визуальная демонстрация может прояснить и показать, например, как избежать образования твердых веществ в маркировочной смеси. Чтобы подготовить этикетировочную среду, дополните DMEM 5% декстраном / древесным углем, покрытым FBS, 1X пенициллином стрептомицином, двумя миллимолярами L-глютамина и 100 миллимолярным пируватом натрия, затем предварительно прогрейте его до 37 градусов Цельсия перед использованием.
Аккуратно вымойте Т-клетки HEK-293, покрытые за день до этого, в чашке для культивирования тканей с шестью лунками pBS, а затем замените PBS маркировочной средой. Инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом в течение примерно 45 минут, прежде чем перейти к метаболической маркировке жирными кислотами. Чтобы омылить аналоги жирных кислот, пипетка по меньшей мере двух микролитров аналога алкиниловой жирной кислоты непосредственно в дно трехмиллилитрового конического реакционного флакона.
Пипетка с равным количеством разбавленного гидроксида калия близка к дну реакционного флакона по краю стакана таким образом, чтобы дозированный объем гидроксида калия смешивался с жирной кислотой. Закройте крышку флакона и осторожно постучите, чтобы перемешать растворы. Нагревайте реакционный флакон при 65 градусах Цельсия в течение примерно пяти минут или до тех пор, пока раствор не станет прозрачным, указывая на то, что жирная кислота была включена.
Однако позаботьтесь о том, чтобы жидкость не испарялась слишком сильно. Далее пипетку предварительно нагревают 20% без жирных кислот BSA таким образом, что объемное отношение жирных кислот к гидроксиду калия к BSA без жирных кислот составляет 1-1-50, достигая конечной концентрации 20X BSA-связанных алкиниловых жирных кислот. Перемешайте раствор путем пипетки вверх и вниз, затем высиживайте его в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия.
Маркируют Т-клетки HEK-293 путем добавления конъюгата 20X жирных кислот BSA непосредственно в среду голодания для достижения конечной концентрации 1% BSA в 25 микромолярного алкинилмиристате или 100 микромоляльных алкинилпальмитате и алкинилстеарате. Для сравнения, добавьте омыленные жидкости, пипетируя два микролитра немаркированной жирной кислоты непосредственно в среду голодания, а затем поместите клетки обратно в инкубатор на три-шесть часов. После того, как инкубация завершена, осторожно промыть клетки PBS при комнатной температуре, затем собрать и лизировать клетки, добавив 500 микролитров модифицированного буфера RIPA без ЭДТА и вращая лизаты в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия.
Центрифугируйте лизаты в 16 000 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, затем соберите супернатант в 1,7-миллилитровые микроцентрифужные трубки и храните их при минус 20 градусах Цельсия. Доведите от 50 до 100 микрограммов белковых лизатов в 1,7-миллилитровых микроцентрифужных трубках до равного объема, используя модифицированный буфер RIPA без ЭДТА. Держите объем реакции как можно меньше.
Добавьте STS к каждому образцу, чтобы достичь конечной концентрации 1% Подготовьте мастер-смесь реагентов и добавьте соответствующие объемы в лизаты, а затем перемешайте путем пипетирования вверх и вниз. Инкубируйте лизаты в темноте в течение 30 минут на водяной бане с температурой 37 градусов Цельсия с периодическим перемешиванием. Для иммунопреципитации смешайте лизаты с анти-GFP кролика и инкубируйте в течение ночи с вращением при четырех градусах Цельсия.
Добавьте в каждую трубку от 15 до 20 микролитров магнитных шариков, предварительно уравновешенных 0,1% SDS RIPA, и дайте ей вступить в реакцию при четырех градусах Цельсия в течение трех часов. Бусины промыть буфером лизиса и повторно суспендировать в 45 микролитрах 50-миллимолярного буфера HEPES, содержащего 1% SDS. Нагревайте бусины при 80 градусах Цельсия в течение 15 минут.
Во время инкубации инвертируйте или перемешивайте трубки примерно каждые пять минут, затем ненадолго раскрутите все трубки. Пока образцы еще теплые, соберите супернатант, содержащий белки. Соедините 43 микролитра супернатанта с семью микролитрами мастер-смеси реагентов и дайте им вступить в реакцию в темноте в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия.
На западном графике наблюдался заметный эффект в эффективности маркировки для обнаружения химии щелчка между омыленными и неомыленными алкиниловыми жирными кислотами с увеличением длины ацильных цепей. В клетках, меченных алкинилстеаратом, омыление жирной кислоты и доставка BSA для метаболической маркировки резко увеличили обнаружение сигнала S-ацилированного белка через химию щелчка и обнаружение флуоресцентным азотопробом, что свидетельствует об общем увеличении клеточного включения метки алкиниловых жирных кислот. И наоборот, не наблюдалось заметной разницы в клетках, обработанных самым коротким и наиболее растворимым жирным кислотным алкинилмиристатом.
Клетки, помеченные алкинилпальмитатом, показали промежуточное увеличение метки по сравнению с алкинилмиристатом, но меньше, чем алкинилстеарат. Важно отметить, что обработка мембран PVDF 0,1 молярным гидроксидом калия в значительной степени удаляла метки жирных кислот из клеток, инкубированных алкинилпальмитатом и алкинилстеаратом, подтверждая, что большая часть сигнала проходила через эфир или тиофирную связь. Как и ожидалось, включение алкинилмиристата было в основном щелочно-устойчивым из-за прикрепления миристата к белкам через амидную связь.
После щелковой химии в иммунопреципитатах, а также лизатах было обнаружено миристоилирование миристоилированного С-концевого GFP Гентингтона дикого типа, тогда как мутация G2A полностью блокировала миристоилирование С-концевого ГФП Хантингтона. Следуя химии щелчка, мы можем выполнить аффинную очистку жирных ацилированных белков для масс-спектрометрии. Это может дать другой профиль жировых ацилированных белков, защищая клетки от токсичности.
