Sıçanlar kullanılarak, bu protokol kimerik HIV kullanarak aktif HIV enfeksiyonunun yeni bir modelini oluşturmak için kullanılabilir. sıçanlar ile, ilaç kullanımı ve nörobilişsel bozukluklar çalışmaları için EcoHIV enfeksiyon modelinin kurulması nöro HIV ve HIV-1 ilişkili nörobilişsel bozuklukların incelenmesine faydalı olabilir. Prosedürü gösteren Hailong Li olacak, laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi.
Virüsün 293 T hücresine paketlenmesi için, DMEM mililitresi başına beş çarpı 10 ila beşinci 293 T hücresi, iki jelatin kaplı 75 santimetrekare şişenin her birine% 10 FBS ile desteklenmiştir ve kültürler% 50 izne ulaşana kadar hücreleri 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırmaktadır. Transfeksiyon gününde, 22,5 mikrolitre transfeksiyon reaktifini 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde şişe başına 750 mikrolitre orta derecede seyreltin ve çözeltiyi üç saniye boyunca girdaplayın. Chimeric EcoHIV plazmid DNA'sının 20 mikrogramını 750 mikrolitre orta derecede, şişe başına ikinci bir 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüpünde iyice karıştırarak seyreltin.
Seyreltilmiş DNA'yı seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi ile nazik karıştırma ile birleştirin ve elde edilen çözeltiyi oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya bırakın. Kuluçkanın sonunda, her virüs süspansiyonunu 10 mililitrelik savaş öncesi DMEM ortamına ekleyin ve her virüs takviyeli çözeltiyi 293 T hücresinden oluşan bir şişeye ekleyin. İki günlük hücre kültüründen sonra, şişelerden gelen süpernatantı santrifüjleme için tek bir 50 mililitre konik tüpte bir araya getirmek ve netleştirilmiş süpernatantı yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın.
Netleştirilmiş süpernatanta sekiz mililitre Lenti-X Konsantratör ekleyin ve yumuşak inversiyonla karıştırın. Dört santigrat derecede iki günlük bir inkübasyondan sonra, karışımı santrifüjleyin ve süpernatantı dikkatlice çıkarın, ardından peleti 100 milimoler PBS'nin 100 mikrolitresi ile hafifçe yeniden kullanın ve virüs konsantrasyonunu titretmek için bir P24 ELISA kiti kullanın. EcoHIV-EGFP enjeksiyonu için, pedal refleksine yanıt eksikliğini onayladıktan sonra, saçları beyin bölgesinden tıraş edin ve maruz kalan cildi% 70 etanol ve klorheksidin bazlı bir ovalama ile iki kez sterilize edin.
Sıçanı stereotaksik bir aparatta eğilimli bir pozisyonda sabitleyin ve kafa derisi orta çizgisi boyunca deriden beş ila altı santimetrelik bir kesi yapın. Bregma'ya 0,8 milimetre yanal ve bir 1,2 milimetre rostralde bir delme pozisyonu işaretleyin ve her kafatası pozisyonunda 0,4 milimetre çapında bir delik açın. Titrek EcoHIV Lentivirus çözeltisinin mililitre başına altıncı transdüksiyon ünitelerine 1.04 kez 10 kez 10 mikrolitre enjeksiyon şırıngasına yükleyin ve şırıngayı stereotaksik aparatlara sabitleyin.
İğneyi bir delme deliğinin yüzeyine yaklaştırın ve iğneyi deliğe 2,5 mililitre yerleştirin. Dakikada 0,2 mikrolitre virüs oranında bir mikrolitre virüs çözeltisi demleyin. Tüm virüs enjekte edildiğinde, iğneyi fare kafatasının dışına çıkıncaya kadar yavaşça geri çekmeden önce iğneyi enjeksiyon bölgesinin içinde beş dakika bekletin.
Cilt kesisini 4-0 ipek iplik dikişi ile kapatın ve çözeltiyi% 70 etanol ile sterilize edin, ardından sıçanı görev süresine kadar izlemeli bir ısıtma yastığı ile bir geri kazanım odasına yerleştirin. Viral infüzyondan bir ila sekiz hafta sonra, pedal refleksine yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, sıçanı bir duman kaputunun içinde bir supine pozisyonunda sabitlayın ve cildi torasik orta hat boyunca inzivaya getirin. Torasik boşluğu açmak için diyaframı kesin ve sol ventrikül içine 25 milimetrelik bir iğne ile 20 ölçer yerleştirin.
Hemen sağ kulakçığı makasla açın ve dakikada beş mililitre debide 50 mililitre önceden soğutulmuş 100 milimoler PBS'yi perfüzyona maruz bırakın. Tüm PBS teslim edildiğinde, 100 mililitre soğuk% 4 paraformaldehit ile perfüzyon. Tüm fiksatif teslim edildiğinde, beyni kafatasından çıkarın ve dokuyu bir gecede taze% 4 paraformaldehitte sabitleyin.
Ertesi sabah, örneği 100 milimolar PBS'de% 30 sakkarozun 40 mililitresine, beyin metil butanoldeki beyin dokusunu eksi 80 santigrat derecede iki dakika dondurmadan önce yaklaşık üç gün boyunca 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Donduktan sonra, 50 mikron kalınlığında koronal bölüm elde etmek için eksi 20 santigrat bir kriyostat ve ince bir boya fırçası kullanın. Tüm bölümler elde edildiğinde, numuneleri 300 mikrolitre anti-solmaya karşı orta ile örtün ve 22 adet 50 mililitrelik kapakla monte edin.
Ortam kuruduğunda, bölümleri konfokal mikroskopi ile görüntüleyin. Lentivirüs enjeksiyonundan yedi gün sonra, sıçan koroner beyin dilimi görüntüleri, beyin dokusu boyunca, özellikle korteks ve hipokampal dentat girus içinde Önemli miktarda EcoHIV-EGFP sinyali varlığını ortaya koymaktadır. Iba1 ve EcoHIV-EGFP probları ile çift etiketleme, mikroglianın beyinde EcoHIV ekspresyonını barındıran baskın hücre tipi olduğuna dair güçlü kanıtlar sağlar.
Enfeksiyondan sekiz hafta sonra, EcoHIV enjekte edilen hayvanlar, tuzlu su kontrollerine kıyasla nispeten daha düz bir aralık fonksiyonu ile kanıtlandıkça, uyaranlar arası aralığın manipülasyonuna görece bir duyarsızlık gösterir. Ek olarak, EcoHIV enjekte edilen sıçanlar, kontrol hayvanlarına göre artan baş ve boyun çaplarına sahip daha kısa dendritik dikenlerin artan göreceli sıklığı ile kanıtlandıkça, dendritik omurga morfolojilerinde derin değişiklikler gösterir. Stereotaksik enjeksiyondan önce durum ortamının konsantrasyonu ve titratingi, deneyler arasında tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçların sağlanması için kritik öneme sahiptir.
EcoHIV'in bu spesifik bölgesel stereotaksik enjeksiyonu beyinde etkili bir HIV enfeksiyonu sağlar ve sıçanlarda zamansal işlem açıkları üretir. EcoHIV enfeksiyon modelini genişletmek için sıçanlarda stereotaksik HIV enjeksiyonlarının kullanılması, eldeki nöro HIV ile ilgili yeni soruları ele almak için önemli bir fırsat sürmektedir.
