Используя крыс, этот протокол может быть использован для установления новой модели активной ВИЧ-инфекции с использованием химерного ВИЧ. на крысах создание модели инфекции EcoHIV для исследований злоупотребления наркотиками и нейрокогнитивных расстройств может быть полезным для изучения нейро-ВИЧ и нейрокогнитивных расстройств, связанных с ВИЧ-1. Демонстрацией процедуры будет Хайлун Ли, научный сотрудник из моей лаборатории.
Для упаковки вируса в 293 Т-клетки семять пять раз по 10 до пятых 293 Т-клеток на миллилитр ДМЭМ, дополненных 10% FBS, в каждую из двух покрытых желатином колб площадью 75 квадратных сантиметров и инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия до тех пор, пока культуры не достигнут 50% конфлюции. В день трансфекции разводят 22,5 микролитра трансфекционного реагента в 750 микролитрах среды на колбу в 1,5 миллилитровой микроцентрифужной трубке и вихряют раствор в течение трех секунд. Развести 20 мкг химерной плазмидной ДНК EcoHIV в 750 микролитрах среды во второй 1,5-миллилитрной микроцентрифуге на колбу с тщательным перемешиванием.
Соединить разбавленный ДНК с разбавленным трансфекционным реагентом с щадящим перемешиванием и инкубировать полученный раствор в течение 15 минут при комнатной температуре. В конце инкубации добавляют каждую суспензию вируса к 10 миллилитрам дожимной среды DMEM и добавляют каждый раствор, дополненный вирусом, в одну колбу из 293 Т-клеток. После двух дней культивирования клеток сконуйте супернатант из колб в одну коническую трубку размером 50 миллилитров для центрифугирования и перенесите осветленный супернатант в новую 50-миллилитровую трубку.
Добавьте восемь миллилитров концентратора Lenti-X к осветленной супернатанту и смешайте с мягкой инверсией. После двухдневной инкубации при четырех градусах Цельсия центрифугируют смесь и аккуратно удаляют супернатант, затем аккуратно повторно суспендируют гранулу 100 микролитрами 100 миллимолярных PBS и используют набор P24 ELISA для титрования концентрации вируса. Для инъекции EcoHIV-EGFP, после подтверждения отсутствия реакции на педальный рефлекс, сбрить волосы из области мозга и стерилизовать открытую кожу два раза с 70% этанолом и скрабом на основе хлоргексидина.
Закрепите крысу в положении лежа в стереотаксическом аппарате и сделайте пяти-шестисантиметровый разрез через кожу вдоль средней линии кожи головы. Отметьте одно положение сверления на 0,8 миллиметра с боковую часть и одно 1,2 миллиметра ростраля до брегмы и просверлите отверстие диаметром 0,4 миллиметра в каждом положении черепа. Загрузите 1,04 раза от 10 до шестой единицы трансдукции на миллилитр титрованного раствора лентивируса EcoHIV в 10-микролитровый инъекционный шприц и закрепите шприц к стереотаксическому аппарату.
Подойдите иглой близко к поверхности одного отверстия и вставьте иглу на 2,5 миллилитра в отверстие. Наполнить один микролитр раствора вируса со скоростью 0,2 микролитра вируса в минуту. Когда весь вирус будет введен, оставьте иглу внутри области инъекции в течение пяти минут, прежде чем медленно втягивать иглу, пока она не выйдет за пределы черепа крысы.
Закройте разрез кожи швом из шелковой нити 4-0 и стерилизуйте раствор 70%-ным этанолом, затем поместите крысу в восстановительную камеру с грелкой с контролем до лежания. Через одну-восемь недель после вирусной инфузии, после подтверждения отсутствия реакции на педальный рефлекс, зафиксируйте крысу в положении лежа на спине внутри вытяжного капюшона и разрезайте кожу вдоль грудной средней линии. Отрежьте диафрагму, чтобы открыть грудную полость и вставьте иглу 20 калибра на 25 миллиметров в левый желудочек.
Немедленно откройте ножницами правое предсердие и пропитайте 50 миллилитров предварительно охлажденного 100 миллимолярного PBS со скоростью пять миллилитров в минуту. Когда все PBS будет доставлено, перфью 100 миллилитров холодного 4% параформальдегида. Когда все фиксаторы будут доставлены, удалите мозг из черепа и зафиксируйте ткань на ночь в свежем 4% параформальдегиде.
На следующее утро поместите образец в 40 миллилитров 30% сахарозы в 100 миллимолярах PBS в 50-миллилитровую трубку примерно на три дня, пока мозг не осядет на дно трубки, прежде чем заморозить ткань мозга в метилбутаноле в течение двух минут при минус 80 градусах Цельсия. После замораживания используйте криостат минус 20 градусов по Цельсию и тонкую кисть, чтобы получить корональные срезы толщиной 50 микрон. Когда все секции будут получены, накройте образцы 300 микролитрами антивяхлой среды и установите их с 22 50-миллилитрными крышками.
Когда среда высохнет, визуализируете участки с помощью конфокальной микроскопии. Через семь дней после инъекции лентивируса изображения коронального среза мозга крыс показывают значительное присутствие сигналов EcoHIV-EGFP по всей ткани мозга, особенно в коре головного мозга и дентильной извилине гиппокампа. Двойная маркировка с помощью зондов Iba1 и EcoHIV-EGFP предоставляет убедительные доказательства того, что микроглия является преобладающим типом клеток, скрывающих экспрессию EcoHIV в мозге.
Через восемь недель после заражения животные, введенные EcoHIV, демонстрируют относительную нечувствительность к манипуляциям с межстимулевым интервалом, о чем свидетельствует относительно более плоская интервальная функция по сравнению с контролем физиологического раствора. Кроме того, крысы, введенные EcoHIV, демонстрируют глубокие изменения в их дендритной морфологии позвоночника, о чем свидетельствует повышенная относительная частота более коротких дендритных шипов с увеличенным диаметром головы и шеи по сравнению с контрольными животными. Концентрация и титрование среды состояния перед стереотаксической инъекцией имеет решающее значение для обеспечения последовательных и воспроизводимых результатов в экспериментах.
Эта специфическая региональная стереотаксическая инъекция EcoHIV обеспечивает эффективную ВИЧ-инфекцию в мозге и вызывает дефицит временной обработки у крыс. Использование стереотаксических инъекций ВИЧ у крыс для расширения модели инфекции EcoHIV предоставляет ключевую возможность для решения новых вопросов, связанных с нейро-ВИЧ.
