このプロトコルは、様々なセットアップで眼遺伝子治療を研究するための最適なシステムとして、5つの哺乳類からの色素上皮細胞の単離およびトランスフェクションを示すため、有意である。この方法の主な利点は、その柔軟性、転写性、高い細胞収率、生存率およびトランスフェクション率が5種および非ウイルス性SB100Xトランスポゾンシステムに使用される。これらの技術は、本プロトコルで単離され、トランスフェクトされている網膜および虹彩色素上皮細胞を標的とした遺伝子治療アプローチを研究するために開発されたが、任意の眼の研究に使用できる。
手順を実証するグレッグ・シーリー、研究室の技術者になります。動物を安楽死させた後、湾曲したはさみと大腸菌の鉗子を使って目を引き、残りの筋肉組織と皮膚を目からきれいにします。無菌PBSで満たされた50ミリリットルのチューブに目を集め、チューブを層流フードに移します。
ヨウ素系溶液に2分間水没して消毒し、滅菌PBSで満たされた50ミリリットルのチューブに目を移します。滅菌ガーゼの圧縮に片目を置き、眼を視神経の近くにしっかりと保持します。その後、11番メスで虹彩の限界付近にカットします。
はさみを使用して、虹彩の周りにカットし、前セグメントを取り除き、ペトリ皿に入れ、網膜色素上皮、またはRPE細胞が単離されるまで、球根をビトリウスに残します。虹彩色素上皮、またはIPE細胞を単離するには、細かい鉗子でレンズを取り外し、IPE細胞を含む虹彩を繊細に引き抜きます。ペトリ皿に虹彩を入れ、滅菌PBSで洗います。
0.25%トリプシンの500マイクロリットルを加え、摂氏37度で10分間インキュベートします。トリプシンを取り外し、500マイクロリットルの完全な媒体を加え、平らで火を磨いたパスツールピペットでIPEを繊細に削ります。細胞懸濁液を回収し、1.5ミリリットルのチューブに入れます。
ノイバウアーチャンバーを使用して細胞を数え、完全な培地の1ミリリットルで24ウェルプレートにウェルあたり0.2百万個の細胞を播種します。プレートをインキュベーターに入れ、摂氏37度と二酸化炭素5%で培養します。RPE細胞を単離するには、薄い鉗子を持つ後部セグメントからビトレウスユーモアとレチナを取り除きます。
24ウェルプレートに電球を入れ、1眼あたり0.25%トリプシンの500マイクロリットルを加え、摂氏37度で10分間インキュベートします。トリプシンを取り除き、1球当たり500マイクロリットルの完全な媒体を加え、湾曲した火で磨かれたパスツールピペットでRPE細胞を繊細に削ります。細胞懸濁液を回収し、1.5ミリリットルのチューブに入れます。
ノイバウアーチャンバーを使用して細胞を数え、前述のように細胞を播種します。プレートをインキュベーターに入れる。目から残った筋肉組織と皮膚をきれいにし、ヨウ素ベースの溶液で目を消毒し、PBSで洗いすります。
IPE細胞を単離するには、レンズを取り外し、前述のように虹彩を引き抜きます。2つのアイリスを調製した後、完全な媒体の1ミリリットルを追加し、平らな、火で磨かれたパスツールピペットで掻いて細胞を分離し、その後、細胞を数えて播種します。プレートをインキュベーターに入れる。
RPE細胞を単離するには、後部セグメントからビトリスとレチナを取り除き、ペトリ皿に電球を入れます。電球に1ミリリットルの完全な媒体を入します。湾曲した火で磨かれたパスツールピペットを使用して、RPE細胞を取り除きます。
1,000マイクロリットルピペットを使用して電球内の細胞懸濁液を回収し、1.5ミリリットルのチューブに移して再懸濁します。次に、細胞を数えて播種し、先に示したようにプレートをインキュベートします。クリーニング後、目を開けて虹彩の周りを切って前のセグメントを取り除き、ペトリ皿に入れます。
RPE細胞が分離されるまで、球根にガラス膜を残します。IPE細胞を単離するには、レンズに前セグメントが付属している場合は、レンズを取り外し、細かい鉗子を使用してIPE細胞を含む虹彩を繊細に引き抜きます。ペトリ皿に虹彩を入れ、滅菌PBSで洗います。
メス番号10で毛様体を切ります。アイライズを準備した後、摂氏37度で0.25%トリプシンの2ミリリットルで10分間インキュベートします。トリプシンを取り出し、完全な媒体の2ミリリットルを追加し、平らな、火で磨かれたパスツールピペットで傷ついて細胞を分離します。
細胞懸濁液を2ミリリットルチューブに移し、120倍G.上清を捨て、完全な培地の2ミリリットルで細胞を再懸濁して10分間遠心分離します。完全な培地の3ミリリットルで6ウェルプレートでウェルあたり0.32百万細胞をシード。プレートをインキュベーターに入れ、摂氏37度と二酸化炭素5%で培養します。
RPE細胞を単離するには、鉗子を持つ後部セグメントからビトレウスユーモアとレチナを取り除きます。網膜色素上皮に損傷を与えないようにしてください。PBSで電球を洗います。
両眼を準備した後、約4分の3の電球をトリプシンで満たし、電球の目の上にペトリ皿の蓋をして摂氏37度で25分間インキュベートします。トリプシンを取り出し、完全な媒体の1ミリリットルを追加します。湾曲した火で磨かれたパスツールピペットを使用して、RPE細胞を取り除きます。
電球内の細胞懸濁液を回収し、1.5ミリリットルチューブに移して再懸濁します。完全な培地の3ミリリットルの6ウェルプレートで120倍G.Seed 0.32万細胞で10分間細胞を遠心分離する。プレートをインキュベーターに入れ、摂氏37度と二酸化炭素5%で培養します。
加湿インキュベーターで37°C、炭酸ガス5%で細胞を培養します。3〜4日後、ピペットを上下にして非接着細胞を採取し、体積の半分を別の井戸に入れます。完全な媒体で1ミリリットルに井戸を充填します。
さらに3〜4日後、細胞採取を繰り返し、今度は非接着性細胞を2つのウェルから1つにプールする。すべての井戸にミディアムを追加します。細胞を観察し、週に2回培地を変更します。
セルが合流に達したら、1%FBS で完全な培地に切り替えます。前述のプロトコルを用いて、IPE細胞とRPE細胞を5種分から正常に単離し、培養した。RPE発現パターンは、RPE65の免疫蛍光によって一次ウシIPE細胞で確認された。
細胞生存率は、市販の細胞毒性アッセイキットおよび結び目電気ポレート制御を用いてエレクトロポレーションバッファーの潜在的毒性を排除することを検討した。細胞生存率への影響は認められない。異種由来の前培養された色素上皮細胞を、黄色蛍光金タンパク質にトランスフェクトした。
トランスフェクトされたRPE19細胞を陽性対照として使用した。前培養ブ豚RPEにおけるトランスフェクション効率の定量をここに示す。新たに単離されたウサギ色素上皮細胞を黄色蛍光タンパク質Venusにトランスフェクトし、顕微鏡検査でモニタリングした。
色素上皮細胞を色素上皮由来因子とトランスフェクトし、ウェスタンブロットによりタンパク質分泌をモニターした。トランスフェクト細胞のシグナルは、研究対象のすべての種および日に対して非トランスフェクト細胞と比較して高く、この時間内にタンパク質分泌の減少は認められなかった。鋭利なツールで細胞を削らないようにすることが重要です。
ここでは、丸いメスを使用しなければならない小さなマウスの目を除いて、火磨きパスツールピペットが使用されます。色素上皮細胞は、遺伝子治療アプローチを開発し、例えば酸化ストレス損傷などの病理学的状態をシミュレートするために使用することができる。これらのモデルはまた、治療薬をテストするために使用することができます。
