3Dバイオリアクターを用いて、滑液間葉系幹細胞からGMPグレードのエキソソームを多数作製するためのプロトコルを提示します。これらのエキソソームは、エキソソーム生物学研究および臨床関節炎治療に利用できる可能性があります。手順を実演するのは、Yujie Liang博士です。
滑液を摂氏4度で10分間1, 500倍Gで遠心分離することにより、ヒト間葉系細胞(MSC)の収集を開始します。遠心分離後、上清を捨て、細胞ペレットを10ミリリットルのPBSで再懸濁します。再懸濁した細胞を摂氏4度で1,500倍Gで10分間遠心分離し、PBSを廃棄してから、ペレットを10ミリリットルのヒトMSC培養培地で10ミリリットルあたり10〜4細胞分の5倍の細胞密度で再懸濁し、懸濁液を100ミリメートルの皿にプレートします。
5%二酸化炭素を含む雰囲気で摂氏37度で皿をインキュベートします。2週間後、細胞培養上清を採取し、フローサイトメトリーを用いて滑液間葉系幹細胞(SF-MSC)を同定します。これを行うには、第3世代の継代3のSF-MSCを摂氏4度で5分間1, 000倍Gで遠心分離して消化します。
その後、菌体ペレットを回収する前に上清を廃棄する。次に、400マイクロリットルのブロッキングバッファーを10〜4倍の濃度でセルペレットに添加し、ペレットを室温で15分間静置する。15分後、前述のように細胞懸濁液を遠心分離し、次いで分離したペレットを100マイクロリットルの1X PBSに再懸濁する。
原稿に記載されているように、チューブあたり1:100の希釈比で1マイクロリットルのモノクローナル蛍光抗体を添加し、インキュベーション用のチューブを室温で30分間置きます。インキュベーション後、細胞を1X PBSで2回洗浄し、100マイクロリットルの1X PBSに細胞を再懸濁します。次に、赤色およびFITCチャンネルを使用して、フローサイトメーター上で最大10, 000個の細胞の蛍光色素を検出します。
マイクロキャリアを調製するには、0.75グラムのマイクロキャリアを1X DPBS中で、1グラムあたり50ミリグラムの濃度で室温で少なくとも3時間膨潤および水和乾燥します。次いで、上清をデカントし、マイクロキャリアを新鮮なDPBSで5分間洗浄した。培地を1グラムあたり50ミリグラムのマイクロキャリアで新しい1X DPBSと交換した後、摂氏121度で15ポンド/平方インチで15分間オートクレーブ滅菌してマイクロキャリアを滅菌します。
次に、上清をデカントする前に、滅菌されたマイクロキャリアを沈降させます。培養液中のマイクロキャリアを、室温でマイクロキャリア1グラムあたり50ミリグラムの濃度ですすぐ。マイクロキャリアが落ち着いたら、上清を捨てる。
灌流バイオリアクターを調製するには、前述のようにオートクレーブによりバイオリアクターを滅菌する。完了したら、SF-MSCの数を数えて、7番目のSF-MSCに10の2.5倍を割り当て、マイクロキャリアを250ミリリットルのGMPグレードMSC培地で灌流したバイオリアクターに割り当てます。バイオリアクターを、毎分15回転の速度で摂氏37度の5%二酸化炭素を含むインキュベーターに入れる。
6日ごとに培地を交換してください。14日後、さらなる分析のために細胞培養上清およびマイクロキャリアを収集する。細胞培養上清を300倍Gで4°Cで10分間遠心分離し、細胞残渣を捨てながら上清を回収する。
摂氏4度で、上清を2, 000倍Gで10分間、次に10, 000倍Gで30分間連続的に遠心分離して、より大きな小胞を廃棄し、ペレットを収集します。ペレットを40ミリリットルのPBSに再懸濁した後、細胞懸濁液を摂氏4度で70分間120, 000倍Gで遠心分離する。次いで、エキソソームを含む回収したペレットを500マイクロリットルのPBSに再懸濁する。
新たに単離したエキソソームサンプルを滅菌PBSでミリリットルあたり10〜7〜10〜9粒子の濃度に希釈し、毎分30マイクロリットル、摂氏24.4〜24.5度でナノ粒子追跡分析(NTAシステム)に500マイクロリットルのサンプルを注入します。メーカーのプロトコルに従って、キャプチャおよび分析システムを手動で設定します。レーザー光散乱によって粒子を視覚化し、デジタルビデオでブラウン運動をキャプチャします。
次に、ソフトウェアを使用して記録されたビデオテープを分析し、実行ごとに少なくとも200個の個別の粒子を追跡します。ウェスタンブロッティングの場合は、300マイクロリットルの溶解バッファーとプロテアーゼ阻害剤カクテルをエキソソームに加え、上下にピペッティングして混合します。次に、氷の上に20分間放置します。
この混合物を摂氏4度で9、391倍Gで10分間遠心分離した後、タンパク質アッセイキットを用いて上清中のタンパク質濃度を測定する。アッセイに続いて、サンプルを100マイクロリットルの4Xタンパク質ローディングバッファーで摂氏100度で10分間加熱します。次に、15マイクロリットルのタンパク質を1ミリリットルあたり10ミリグラムの濃度でロードし、120ボルトで70分間ゲル電気泳動を行い、摂氏4度で100ボルトで60分間エレクトロブロッティングします。
カルネキシンなどの非エキソソーム特異的マーカーと、CD9、CD63、CD81などのエキソソームバイオマーカーを蛍光ウエスタンブロッティングにより検出します。フローサイトメトリー分析の結果、培養SF-MSCはCD34、CD45、HLA-DRが陰性、CD73、CD90、CD105が陽性であり、MSCの同定基準を満たしていることが明らかになりました。
倒立顕微鏡下では、SF-MSCがマイクロキャリア上で増殖することが注目された。SF-MSCは、2D培養と比較して、6日以降、3D培養においてより早く増殖した。2Dおよび3D培養のSF-MSC由来のエキソソームをウエスタンブロッティングにより同定し、カルネキシン陰性ながらCD63、CD9、およびCD81を発現していることがわかりました。
ナノサイト分析により、2Dおよび3Dエクソソームの直径は約120ナノメートルであることが示されました。透過型電子顕微鏡分析により、2Dおよび3Dエキソソームの形態が明らかになり、おおむね回転楕円体小胞が示されました。NTA分析を用いて、30〜160ナノメートルサイズの粒子の濃度を分析した。
3D培養後、粒子濃度は10〜6ミリリットルあたり4.0倍であった。しかし、2D培養後、同サイズの粒子の濃度は1ミリリットルあたり10〜6倍の2.5倍であった。さらに、3D培養は2D培養よりも多くのエキソソームタンパク質を産生した。
代表的な分析は、初代軟骨細胞によるディル標識エキソソームの内在化を示す。初代軟骨細胞に入ったジル標識エキソソームは、3時間目にピークを有するのが見られる。インビトロ送達研究は、エキソソームがスルホシアニン3標識マイクロRNA-140を軟骨細胞に送達できることを実証した。
細胞のプレーティング、バイオリアクターでの反応の開始、および上清のプレーティングは、このプロトコルの最も重要なステップです。3D培養は、接着細胞の大規模培養に一般的に使用されます。スピンフレックスなどの他の方法も、エキソソームの大規模生産に使用できます。
私たちの方法は、エキソソームの収率を改善し、MSCエキソソームベースの前臨床アプリケーションを可能にします。
