이러한 프로토콜은 2색 ddPCR 시스템을 사용하여 SARS-CoV-2 검출을 위한 사내 다중 ddPCR 분석을 개발하는 데 사용할 수 있습니다. 이것은 SARS-CoV-2 및 기타 병원체 검출을 위한 자체 키트를 개발하려는 사람들에게 유용합니다. 금본위제 RT-qPCR과 비교하여 RT-ddPCR은 표준 곡선 없이 여러 SARS-CoV-2 유전자를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.
ddPCR은 새로운 기술이기 때문에 현재 및 미래의 사용자가 SARS-CoV-2 검출 및 기타 병원체에 대한 다중 분석을 이해하고 쉽게 개발할 수 있도록 시각적 시연이 중요합니다. cDNA 합성의 경우, 5X 역전사 마스터 믹스 2마이크로리터, 관심 RNA 샘플 5마이크로리터 및 RNase가 없는 이중 증류수 3마이크로리터를 용액으로 100 또는 200 마이크로리터 PCR 튜브에 넣고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 시약이 추가되면 샘플을 열 순환기에 로드하고 섭씨 37도에서 15분 동안 역전사를 실행하고, 섭씨 85도에서 5초 동안 역전사를 열 비활성화하고, 섭씨 4도에서 최종 무한 유지를 실행하도록 기기를 설정합니다.
액적 디지털 PCR을 수행하기 전에 새로 준비된 마스터 믹스 19.8마이크로리터를 뉴클레아제가 없는 96웰 액적 디지털 PCR 플레이트의 적절한 수의 웰에 추가합니다. 마스터 믹스의 각 웰에 2.2 마이크로리터의 cDNA를 웰 당 22 마이크로리터의 반응 믹스의 최종 부피에 첨가하고, 일회용 PCR 플레이트 실러로 플레이트를 밀봉한다. 이어서, 플레이트를 10 내지 15초 동안 원심분리기에서 15 내지 30초 동안 와동시켜 플레이트의 바닥에 웰 내용물을 수집하였다.
자동 액적 발생기 터치스크린에서 자동 액적 생성을 위해 샘플 플레이트 구성을 클릭하고 샘플 플레이트에서 샘플이 있는 컬럼을 선택합니다. 확인을 클릭하고 자동 액적 발생기 도어를 엽니다. 시료와 액적 생성 플레이트 및 실험에 필요한 기타 재료를 기기 내의 각 위치에 넣고 도어를 닫습니다.
터치스크린이 녹색으로 바뀌어 모든 재료가 올바른 위치에 로드되었음을 나타내면 프로브용 오일을 선택하고 액적 생성을 시작합니다. 화면에 표시된 시간에 따라 액적 생성이 완료될 때까지 기다립니다. 화면에 Droplets ready(물방울 준비)가 표시되면 도어를 열어 물방울이 포함된 플레이트를 제거하고 플레이트 실러를 섭씨 180도에서 5초 동안 사용하여 피어싱 가능한 호일 씰로 플레이트를 밀봉합니다.
액적 생성 후 30분 이내에 밀봉된 액적 플레이트를 96 깊이의 우물 열 순환기에 넣습니다. 샘플 부피를 40마이크로리터로 설정하고 뚜껑 온도를 섭씨 105도로 설정합니다. 그런 다음 PCR은 액적을 증폭합니다.
액적 판독을 위해 증폭 후 열 순환 96웰 플레이트를 액적 판독기로 옮기고 액적 판독기에 연결된 컴퓨터에서 함께 제공되는 소프트웨어를 엽니다. 설정 모드에서 새로 만들기를 선택하고 아무 웰이나 두 번 클릭하여 웰 편집기 대화 상자를 엽니다. 판독할 웰을 선택하고 실험을 절대 정량화로 설정하고, 프로브용 슈퍼믹스를 액적 디지털 PCR 슈퍼믹스로 설정합니다.
한 가지 유형을 알 수 없는 채널 1로 지정하고 두 가지 유형을 알 수 없는 채널 2로 지정합니다. 플레이트 레이아웃에 따라 샘플 이름을 할당하고 적용(apply) 및 확인(okay)을 클릭합니다. 템플릿을 저장한 후 Run(실행)을 클릭합니다.
소프트웨어에서 메시지가 표시되면 FAM/HEX 색상을 선택합니다. 데이터 수집이 끝나면 리더에서 플레이트를 제거합니다. 데이터를 분석하기 전에 모든 웰의 데이터를 확인하여 총 액적 수를 구하십시오.
그리고 양성 또는 음성 결과로 계산할 최소 수의 물방울을 수용하도록 컷오프를 설정합니다. 심플렉스 및 듀플렉스 분석 분석의 경우 분석할 QLP 파일을 두 번 클릭하고 분석을 선택합니다. 1D 진폭 및 2D 진폭 임계값 툴을 사용하여 노드 템플릿 대조군 및 양성 대조군 샘플을 가이드로 사용하여 올바른 채널의 각 웰에 대한 양수 및 음수 액적을 구별합니다.
그런 다음 추가 분석을 위해 결과를 CSV 파일로 내보냅니다. 삼중 프로브 혼합 분석의 경우 QLP 파일을 열고 플레이트 편집기 탭에서 분석할 웰을 선택합니다. 실험 유형을 직접 정량화로, 분석을 프로브 믹스 트리플렉스로 설정하고 대상 이름을 입력합니다.
그런 다음 적용을 클릭합니다. 그래프 도구를 사용하여 select to assign clusters(클러스터 할당 선택) 창 팝업 제안의 지시에 따라 다른 대상 클러스터에 특정 색상을 할당합니다. 모든 대상 색상이 할당되면 정량화 데이터가 웰 데이터 창에 표시됩니다.
다운스트림 분석을 위해 데이터를 CSV 파일로 내보냅니다. 4중 분석의 경우 실험 유형을 직접 정량화로 설정하고 분석을 진폭 다중화로 설정합니다. 대상 이름을 입력하고 적용을 클릭합니다.
그래프 도구를 사용하여 select to assign clusters(클러스터 할당 선택) 창 팝업 제안의 지시에 따라 다른 대상 클러스터에 특정 색상을 할당합니다. 모든 대상 색상이 할당되면 정량화 데이터가 웰 데이터 창에 표시됩니다. 추가 분석을 위해 데이터를 CSV 파일로 내보냅니다.
이 대표적인 온도 구배 분석에서 관찰된 바와 같이, 이중 분석을 실행할 때 더 높은 무릎 꿇는 온도는 양의 물방울과 음의 물방울을 명확하게 구별할 수 없었습니다. 그러나 무릎을 꿇는 온도가 감소함에 따라 양수 및 음수 물방울 사이의 최적 분리가 달성되었습니다. 2색 RT 액적 디지털 PCR 검출 시스템을 사용하여 단일 샘플 내에서 1개, 2개, 3개 및 4개의 SARS-CoV-2 표적을 검출할 수 있습니다.
템플릿이 없는 대조군 샘플은 심플렉스 분석에서 음성 임계값을 설정하는 데 도움이 되는 음성 방울을 찾는 데 사용할 수 있습니다. 듀플렉스 분석에서 분석은 개별 채널 또는 2D 진폭에서 수행할 수 있습니다. 고차 멀티플렉스 어세이 데이터 분석은 간단하지 않지만, 이러한 어세이는 삼중 프로브 혼합 어세이에서 최대 8개의 액적 클러스터를 평가할 수 있고 사중 진폭 기반 어세이의 경우 최대 16개의 액적 클러스터를 평가할 수 있기 때문에 유용합니다.
개발할 분석법에 따라 올바른 표적 프라이머와 프로브 농도가 마스터 믹스에 추가되었는지 확인하십시오. 이 절차를 사용하여 새로운 RT-ddPCR 분석을 개발하기 위해 표적을 교체할 수 있습니다. 이 분석은 다양한 연구 목적이나 신종 전염병 진단에 사용할 수 있습니다.
개발 이후, 이 기술은 다양한 표준, 인체 및 환경 샘플에서 바이러스 핵산 사본의 정확한 측정에 사용되었습니다.
