用于SARS-CoV-2检测和定量的两步逆转录液滴数字PCR方案

这些协议可用于开发内部多重 ddPCR 检测，用于使用双色 ddPCR 系统检测 SARS-CoV-2。这对于想要开发自己的试剂盒来检测SARS-CoV-2和其他病原体的人来说很有用。与金标准 RT-qPCR 相比，RT-ddPCR 可用于定量多个 SARS-CoV-2 基因，而无需标准曲线。

由于 ddPCR 是一种新兴技术，因此视觉演示对于帮助当前和未来的用户了解和轻松开发用于 SARS-CoV-2 检测和其他病原体的多重检测非常重要。对于cDNA合成，将两微升5X逆转录预混液，5微升目标RNA样品和3微升无RNase双蒸水中加入100或200微升PCR管中至最终体积为10微升作为溶液，并将管放在冰上。添加试剂后，将样品加载到热循环仪中，并将仪器设置为在 37 摄氏度下运行逆转录 15 分钟，在 85 摄氏度下对逆转录进行 5 秒的热灭活，并在 4 摄氏度下最终无限保持。

在进行液滴数字PCR之前，将19.8微升新鲜制备的预混液加入到无核酸酶96孔液滴数字PCR板的适当孔数中。向预混液的每个孔中加入2.2微升cDNA，每孔的最终体积为22微升反应混合物，并用一次性PCR板密封机密封板。然后，在离心机中将板涡旋15至30秒10至15秒，以收集板底部的孔内容物。

要在自动液滴发生器触摸屏上自动生成液滴，请单击配置样品板并选择样品位于样品板上的色谱柱。单击确定并打开自动液滴发生器门。将样品和液滴发生板以及实验所需的其他材料装入仪器内的相应位置并关闭门。

当触摸屏变为绿色时，表示所有材料都已加载到正确的位置，为探头选择油并开始产生液滴。等待液滴生成根据屏幕上指示的时间运行完成。当屏幕显示液滴准备就绪时，打开门以取出包含液滴的板，并在 180 摄氏度下使用板封口机五秒钟，用可刺穿的箔密封密封板。

在液滴产生后 30 分钟内，将密封的液滴板放入 96 深孔热循环仪中。将样品体积设置为 40 微升，将盖子温度设置为 105 摄氏度。然后，PCR扩增液滴。

对于液滴读数，扩增后，将热循环的96孔板转移到液滴读数器中，并在连接到液滴读取器的计算机上打开随附的软件。在设置模式下，选择新建并双击任何孔以打开井编辑器对话框。选择要读取的孔并将实验设置为绝对定量，超混料到液滴数字PCR超混料，用于探针。

将一种类型定位到通道 1 未知，将两种类型定位到通道 2 未知。根据板布局分配样品名称，然后单击应用并确定。保存模板后，单击运行。

当软件提示时，选择 FAM/HEX 颜色。在数据采集结束时，从阅读器上取下板。在分析数据之前，检查所有孔的数据以获得液滴总数。

并设置一个截止值，以接受最小数量的液滴计为阳性或阴性结果。对于单纯和双链分析，请双击要分析的 QLP 文件，然后选择分析。使用1D振幅和2D振幅阈值工具区分正确通道中每个孔的正液滴和负液滴，使用节点模板对照和阳性对照样品作为指导。

然后，将结果导出为 CSV 文件以进行其他分析。对于三重探针混合测定，打开QLP文件并在板编辑器选项卡中选择要分析的孔。将实验类型设置为直接定量，将测定设置为探针混合三重，然后输入目标名称。

然后单击应用。使用图形工具将特定颜色分配给不同的目标聚类，按照选择分配聚类窗口弹出窗口建议的指示。分配所有目标颜色后，定量数据将显示在孔数据窗口中。

将数据导出为 CSV 文件以进行下游分析。对于四链体测定，将实验类型设置为直接定量，将测定设置为幅度多重。输入目标名称，然后单击应用。

使用图形工具将特定颜色分配给不同的目标聚类，按照选择分配聚类窗口弹出窗口建议的指示。分配所有目标颜色后，定量数据将显示在孔数据窗口中。将数据导出为 CSV 文件以进行其他分析。

正如在这种代表性的温度梯度分析中观察到的那样，当进行双链测定时，较高的跪姿温度无法清楚地区分阳性液滴和阴性液滴。然而，随着跪姿温度的降低，正负液滴之间的最佳分离实现了。使用双色RT液滴数字PCR检测系统，可以在单个样本中检测一个，两个，三个和四个SARS-CoV-2靶标。

无模板对照样品可用于定位阴性液滴，以帮助设置单纯形测定中的阴性阈值。在双链分析中，可以在单个通道或 2D 振幅下进行分析。虽然高阶多重检测数据分析并不简单，但这些检测是有用的，因为它们允许在三重探针混合物测定中评估多达 8 个液滴簇，在基于四链体振幅的测定中评估多达 16 个液滴簇。

根据要开发的检测方法，确保将正确的靶标引物和探针浓度添加到预混液中。使用该程序，可以交替靶标以开发新的RT-ddPCR测定。该测定可用于不同的研究目的或诊断新出现的传染病。

自开发以来，该技术已用于准确测定不同标准品、人体和环境样品中的病毒核酸拷贝。