Esses protocolos podem ser usados para desenvolver ensaios internos de ddPCR multiplex para detecção de SARS-CoV-2 usando um sistema ddPCR de duas cores. Isso é útil para pessoas que querem desenvolver seus próprios kits para a detecção de SARS-CoV-2 e outros patógenos. Em comparação com o RT-qPCR padrão-ouro, o RT-ddPCR pode ser usado para quantificar vários genes SARS-CoV-2 sem a necessidade de uma curva padrão.
Uma vez que o ddPCR é uma técnica emergente, a demonstração visual é importante para ajudar os usuários atuais e futuros a entender e desenvolver facilmente ensaios multiplex para detecção de SARS-CoV-2 e outros patógenos. Para a síntese de cDNA, adicione dois microlitros de mistura mestre de transcrição reversa 5X, cinco microlitros da amostra de RNA de interesse e três microlitros de água bidestilada livre de RNase em um tubo de PCR de 100 ou 200 microlitros para um volume final de 10 microlitros como solução e coloque o tubo sobre gelo. Quando os reagentes tiverem sido adicionados, carregue a amostra em um termociclador e ajuste o instrumento para executar uma transcrição reversa a 37 graus Celsius por 15 minutos, uma inativação de calor da transcrição reversa por 5 segundos a 85 graus Celsius e uma retenção infinita final a quatro graus Celsius.
Antes de realizar a PCR digital de gotículas, adicione 19,8 microlitros de mistura mestre recém-preparada ao número apropriado de poços de uma placa de PCR digital de gotículas de 96 poços livre de nucleases. Adicione 2,2 microlitros de cDNA a cada poço de mistura mestra para um volume final de 22 microlitros de mistura de reação por poço e sele a placa com um selador de placa de PCR descartável. Em seguida, agite a placa por 15 a 30 segundos em centrífuga por 10 a 15 segundos para coletar o conteúdo do poço no fundo da placa.
Para a geração automatizada de gotículas na tela sensível ao toque do gerador de gotículas automatizado, clique em configurar a placa de amostra e selecione as colunas nas quais as amostras estão localizadas na placa de amostra. Clique em OK e abra a porta do gerador de gotículas automatizado. Coloque as placas geradoras de amostras e gotículas e os demais materiais necessários para o experimento nos respectivos locais dentro do instrumento e feche a porta.
Quando a tela sensível ao toque ficar verde, indicando que todos os materiais foram carregados em suas posições corretas, selecione o óleo para as sondas e inicie a geração de gotículas. Aguarde a geração da gotícula ser concluída de acordo com o tempo indicado na tela. Quando a tela disser Gotículas prontas, abra a porta para remover a placa que contém as gotículas e use um selador de placa por cinco segundos a 180 graus Celsius para selar a placa com um selo de folha perfurável.
Dentro de 30 minutos após a geração da gotícula, coloque a placa de gotícula selada em um termociclador de poço profundo de 96 anos. Ajuste o volume da amostra para 40 microlitros e a temperatura da tampa para 105 graus Celsius. Em seguida, a PCR amplifica as gotículas.
Para a leitura das gotículas, após a amplificação, transfira a placa termociclada de 96 poços para um leitor de gotículas e abra o software que a acompanha em um computador conectado ao leitor de gotículas. No modo de configuração, selecione Novo e clique duas vezes em qualquer poço para abrir a caixa de diálogo do editor de poços. Selecione os poços a serem lidos e defina o experimento para quantificação absoluta, supermix para supermix de PCR digital para sondas.
Direcione um tipo para o canal 1 desconhecido e direcione dois tipos para o canal 2 desconhecido. Atribua os nomes de exemplo com base no layout da chapa e clique em aplicar e ok. Depois de salvar o modelo, clique em Executar.
Quando solicitado pelo software, selecione a cor FAM/HEX. Ao final da aquisição de dados, remova a placa do leitor. Antes de analisar os dados, verifique os dados de todos os poços para obter o número total de gotículas.
E defina um ponto de corte para aceitar um número mínimo de gotículas a serem contadas como resultados positivos ou negativos. Para análise de ensaios simplex e duplex, clique duas vezes no arquivo QLP a ser analisado e selecione Analisar. Use as ferramentas de amplitude 1D e limiar de amplitude 2D para distinguir entre as gotículas positivas e negativas para cada poço no canal correto, usando o controle de modelo de nó e amostras de controle positivo como guia.
Em seguida, exporte os resultados como um arquivo CSV para análise adicional. Para um ensaio de mistura de sonda triplex, abra o arquivo QLP e selecione os poços a serem analisados na guia editor de placas. Defina o tipo de experimento para quantificação direta e o ensaio para sonda mistura triplex, e insira o nome do destino.
Em seguida, clique em Aplicar. Use as ferramentas de gráfico para atribuir cores específicas a diferentes clusters de destino, conforme indicado pela seleção para atribuir sugestões pop-up de janela de cluster. Quando todas as cores de destino tiverem sido atribuídas, os dados de quantificação serão exibidos na janela de dados do poço.
Exporte os dados como um arquivo CSV para análise downstream. Para um ensaio quadruplex definir o tipo de experimento para quantificação direta e o ensaio para amplitude multiplex. Insira o nome do destino e clique em Aplicar.
Use as ferramentas de gráfico para atribuir cores específicas a diferentes clusters de destino, conforme indicado pela seleção para atribuir sugestões pop-up de janela de cluster. Quando todas as cores de destino tiverem sido atribuídas, os dados de quantificação serão exibidos na janela de dados do poço. Exporte os dados como um arquivo CSV para análise adicional.
Como observado nesta análise de gradiente de temperatura representativo, temperaturas mais altas de ajoelhamento não foram capazes de distinguir claramente gotículas positivas de gotículas negativas quando um ensaio duplex foi executado. No entanto, com a diminuição da temperatura de ajoelhamento, obteve-se uma separação ótima entre gotículas positivas e negativas. Usando um sistema de detecção digital de PCR de gotículas RT de duas cores, é possível detectar um, dois, três e quatro alvos do SARS-CoV-2 em uma única amostra.
Uma amostra de controle sem modelo pode ser usada para localizar gotículas negativas para ajudar a definir o limiar negativo em ensaios simplex. Em ensaios duplex, a análise pode ser realizada em canais individuais ou na amplitude 2D. Embora a análise de dados de ensaios multiplex de ordem superior não seja simples, esses ensaios são úteis, pois permitem que até oito grupos de gotículas sejam avaliados em ensaios de mistura de sonda triplex e até 16 clusters de gotículas para ensaios baseados em amplitude quádrupla.
Dependendo do ensaio a ser desenvolvido, certifique-se de que as concentrações corretas do primer alvo e da sonda sejam adicionadas à mistura mestre. Usando este procedimento, pode-se alternar os alvos para desenvolver novos ensaios RT-ddPCR. Estes ensaios podem ser usados para diferentes propósitos de pesquisa ou para o diagnóstico de doenças infecciosas emergentes.
Desde o seu desenvolvimento, esta técnica tem sido utilizada para a determinação precisa de cópias de ácidos nucleicos virais em diferentes padrões, no corpo humano e em amostras ambientais.
